連接蛋白43在豬冠狀動脈平滑肌細胞表型轉換中的作用

馬曉燁 張旭敏 王小東 姚義安

(上海市同濟大學附屬東方醫院心內科，上海 200120)

隨著社會物質生活富裕與老齡化趨勢加速，冠心病在我國的發病率也越來越高。然而血管平滑肌細胞(VSMC)的增殖是導致動脈粥樣硬化和冠狀動脈支架術后再狹窄等的心血管疾病的重要原因〔1～3〕。在動脈粥樣硬化形成的早期階段，VSMC受到血小板源生長因子(PDGF-BB)的刺激導致細胞增殖和遷移，促進動脈粥樣硬化斑塊的增大。介入治療是嚴重狹窄的動脈粥樣硬化的血管病變的主要治療手段，但治療時手術損傷深達中膜，激活血小板活化釋放化學因子如PDGF-BB，造成的原位損傷修復反應能刺激VSMC的增殖和遷移，同時VSMC遷移的細胞形態發生改變，從而導致新生血管形成和顯著的血管狹窄〔4,5〕。因此，研究VSMC增殖的機制對控制動脈粥樣硬化和支架內再狹窄的預防有重要意義。已有研究報道，縫隙連接在動脈粥樣硬化中起重要作用，其中縫隙連接蛋白(Cx)43在平滑肌細胞(SMC)增殖中作用明顯〔6～10〕，但Cx43表達與細胞形態變化關系尚不明確。本研究以PDGF-BB作為體外培養的冠狀動脈SMC細胞的刺激源，觀察細胞表型轉換與Cx43蛋白表達量的關系，探討Cx43對冠狀動脈SMC細胞表型轉換的影響，從而闡明Cx43表達在冠狀動脈介入治療術后再狹窄中的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料 細胞培養基(DMEM，美國GIBCO公司)培養,20%的胎牛血清(FCS，美國GIBCO公司)、電泳儀(美國Bio-Rad公司Mini Protein Ⅱ型)、投射電鏡 (日本Olympus公司)、PCR儀(Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System)、光鏡觀察(日本olympus公司)、胰酶(Gibco公司)、S100A4、α-SMA 兔二抗體均為Abcam公司生產，其他試劑均為國產。

1.2SMC培養 根據同濟大學動物倫理委員會批準，將3月齡家豬雌雄不限處死，分離冠狀動脈前降支、回旋支、右冠狀動脈，縱形破開分離出中層，進行原代細胞培養；SMC培養基(DMEM，美國GIBCO公司)培養,加入20%的FCS放入37℃，體積分數5%的CO2培養箱(Thermo公司)，逐日倒置顯微鏡觀察，每隔3 d換1次液。

1.3冠狀動脈SMC應用PDGF誘導 經原代培養正常冠脈平SMC在含20%FCS的DMEM中培養，將貼壁90%細胞用胰酶消化1 min后，依次鋪入6孔板內，24 h貼壁牢固后，加入PDGF-BB (10 ng/ml,Roche)共同培育，PDGF-BB濃度為10 ng/ml作用24 h；然后加入連接蛋白阻斷劑(18-α-glycyrrhetinic acid濃度100 μmol/L)阻斷作用48 h，后分別在24、48 h電鏡觀察細胞結構變化及連接蛋白變化〔8〕。

實驗分為三組：正常對照組，誘導組：PDGF-BB(10 ng/ml)，阻斷組：PDFG-BB(10 ng/ml)+Cx43阻斷劑(100 μmol/L)。各組細胞培養24 h后收集用于以下各項指標檢測。

1.4電鏡觀察各組細胞形態與結構 離心收集貼壁細胞，2.5%戊二醛固定2～3 h，1%娥酸固定2～3 h，脫水臨界點干燥，3%醋酸鈉枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡(日本Olympus公司)觀察SMC的形態與結構。

1.5Western 印跡檢測蛋白表達 采用Western 印跡方法檢測Cx43、Cx40、α-SMA、S100A4的蛋白表達。離心收集貼壁細胞，提取蛋白質，進行樣品總蛋白含量測定，制膠，制備蛋白質樣品并加樣，免疫印跡顯色，抗體均為Abcam公司生產，將膜放入曝光儀器中，滴加發光液，曝光3次，5 min/次，選擇3次曝光的重疊值。

1.6實時熒光定量PCR測定Cx43、Cx40 mRNA的表達 Trizol一步法抽提平滑肌細胞正常對照組、誘導組及阻斷組冠狀動脈平滑肌細胞RNA。測定總RNA純度、濃度及RNA完整性的檢測，進行逆轉錄反應及cDNA合成(RT)和聚合酶鏈式反應(PCR)。放入熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System)，反應結束后，儀器自動進行溶解曲線分析，并計算得到每個樣本的CT值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參照，計算得到目的基因mRNA的含量。

2 結 果

2.1顯微鏡觀察細胞形態變化 光鏡觀察結果見圖1。通過電鏡檢查可見加入10 ng/ml PDFG-BB后細胞增殖加速分化。正常冠狀動脈SMC呈紡錘狀形態(S-SMC)，胞漿內含SMC特征性結構肌絲和密體，細胞內高爾基體粗面內質網和游離核糖體含量很少。誘導組呈長菱形(R-SMC)，核呈鋸齒狀，核大且呈異染性，核漿比例及平均細胞直徑均較大，粗絲和密體減少，胞內粗面內質網擴張，游離核糖體豐富，并含有大量高爾基體。當加入100 μmol/ml Cx43阻斷劑后又抑制增殖，細胞恢復成S-SMC，細胞內高爾基體粗面內質網和游離核糖體含量減少。見圖2。

圖1 顯微鏡觀察細胞形態變化(×100)

圖2 電鏡下結果(×200)

2.2Western 印跡檢測蛋白表達 與對照組相比，經PDFG-BB誘導后，Cx43、S100A4(R-SMC的標志)的蛋白表達量增加(P<0.01)，Cx40、α-SMA(SMC分化標志)的蛋白表達量減少(P<0.01)；而加入Cx43阻斷劑后Cx43、S100A4的蛋白表達量減少(P<0.01)， Cx40、α-SMA蛋白表達量增加(P<0.01)，見圖3。

2.3實時熒光定量PCR測定mRNA的表達 實時熒光定量PCR測定mRNA的表達：在對照組，Cx40的mRNA表達較高，Cx43少量表達；與誘導組相比較，Cx43的mRNA表達顯著升高(P<0.01)，Cx40表達明顯減少(P<0.01)；阻斷組通過反義RNA降低Cx43表達，這種變化受抑制，且阻斷組與誘導組在Cx43及Cx40mRNA的表達有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

圖3 Western 印跡檢測誘導后及阻斷后蛋白變化

圖4 PDGF-BB誘導及阻斷Cx40、Cx43表達

3 討 論

經皮冠狀動脈介入治療(PCI)是冠心病最有效治療手段之一，但術后再狹窄影響遠期療效。再狹窄是一種局部血管對損傷的反應過程，包括炎性細胞的浸潤和血小板的聚集釋放各種細胞因子和生長因子，刺激血管中層SMC的增殖、遷移、表型轉換，以及分泌細胞外基質，最終導致血管內膜增厚以及血管狹窄〔11,12〕。

動脈粥樣硬化斑塊的形成包括SMC從中層向內膜的遷移，在內膜受到PDFG等細胞因子的刺激而導致的增殖，以及細胞外基質的合成。Cx在SMC表型轉換中可能起了重要作用。研究發現收縮型SMC向合成型SMC轉換中有更多的縫隙連接，同時細胞中Cx43表達上調〔13〕。為進一步說明以上問題本文采用體外培養冠狀動脈SMC，模擬體內動脈硬化過程觀察細胞表型變化與蛋白表達關系，從而闡明再狹窄過程。正常冠狀動脈血管中層SMC有S-SMC和R-SMC，與S-SMC相比，R-SMC具有較高的增殖、遷移和合成、分泌大量細胞外基質的能力，但分化能力較差〔14〕。本研究結果與以往報道結果一致〔8〕。

SMC之間通過Cx參與相鄰細胞間的物質和信息交換〔15〕。連接蛋白在哺乳動物組織和細胞中廣泛表達，SMC中主要表達Cx43、Cx37、Cx40和Cx45〔16〕。Cx43在動脈粥樣斑塊形成中可見較高的表達〔7,17〕，而降低Cx43表達可以限制小鼠動脈粥樣硬化和斑塊的發展〔18〕。研究〔19〕報道給予Cx43+/-LDLR-/-小鼠高脂飼料喂養14 w后，與Cx43+/+LDLR-/-小鼠相比，其動脈粥樣硬化斑塊減小，而且斑塊中出現較少的炎癥細胞和帶有更多膠原蛋白和SMC的厚纖維帽，提示限制Cx43表達不僅可以減少斑塊面積，而是可以穩定斑塊，后者可能與Cs43抑制巨噬細胞活性有關。在小鼠頸動脈球囊擴張損傷的動物模型中，與Cx43+/+LDLR-/-小鼠相比，Cx43+/-LDLR-/-小鼠血管炎性反應減輕，并且可以降低SMC增殖與遷移〔20〕。

然而，Cx43在動脈粥樣硬化中具體機制仍不清楚。以往研究認為，VSMC表型轉換可能與氧化型低密度脂蛋白中的氧化磷脂成分POVPC和PGPC有關。POVPC降低Cx43的表達水平，但增加了其絲氨酸279/282磷酸化，導致SMC增殖；然而PGPC增加了Cx43絲氨酸368磷酸化，但并沒有促進SMC的進一步增殖〔6〕。Johnstone等〔21〕的研究發現PDGF通過Cx43的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化促進血管SMC增殖，而在血管損傷后Cx43的MAPK磷酸化可以顯著增加新生血管形成。但其作用機制仍有待于進一步研究。

綜上，PDGF-BB誘導SMC由S-SMC向R-SMC轉換，伴有Cx43表達升高，細胞增殖，而阻斷Cx43表達后SMC向S-SMC轉換，抑制細胞增殖，但其具體作用機制仍有待于進一步研究，通過本研究為冠狀動脈粥樣硬化及PCI術后再狹窄的防治提供新的理論基礎。

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