非酒精性脂肪肝動物模型研究進展

李強 傅繼華

（1 中國藥科大學2010 級藥理學碩士研究生 江蘇南京210009；2 中國藥科大學生理教研室 江蘇南京210009）

非酒精性脂肪肝 (Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是一種無過量飲酒史，但病理學改變類似酒精性脂肪性肝病，以肝細胞脂肪變性和脂質貯積為特征的臨床病理綜合征[1]。近年來隨著人民生活水平的提高，高熱量的飲食習慣和不良的生活方式使得肥胖、高脂血癥、糖尿病及由此引起的NAFLD 的發病率有明顯上升的趨勢。雖然脂肪肝被認為是良性病變，但它是許多慢性肝臟疾病的早期階段。

1 NAFLD 的發病機制

“二次打擊”學說是Day 等在1998 年提出的[2]，目前已被廣泛接受。一次打擊主要是胰島素抵抗導致肝細胞脂肪變性，形成單純性脂肪肝。二次打擊因素通過增強脂質過氧化反應和(或)刺激Kupfer 細胞釋放炎性介質，引起脂肪變性的肝細胞發生氣球樣變和點狀壞死，同時吸引中性粒細胞和淋巴細胞趨化至肝小葉內，形成脂肪性肝炎。并在此基礎上促進肝星狀細胞激活、轉化和合成細胞外基質，從而誘發進展性肝纖維化。

2 NAFLD 的動物模型研究

目前對脂肪肝的防治研究日益成為醫學關注和研究的焦點，建立不同方法不同因素誘發的脂肪肝動物模型對脂肪肝的發病機制研究和藥物治療開發尤為重要。NAFLD 動物模型采用的實驗動物主要有大鼠、小鼠、沙鼠、家兔、家鴨、小型豬等，但以大鼠造模最為常見。本文重點圍繞大鼠NAFLD模型的研究進展進行綜述。

2.1 營養失調性脂肪肝模型 此類模型是通過12周以上的高脂肪、高膽固醇和/或高糖高淀粉飼料喂養誘發的非酒性脂肪肝模型。成模標準是造模組相對于對照組，血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Total Cholesterol, TC)、游離脂肪酸(Free Fatty Acid, FFA) 和低密度脂蛋白 (Low Density Lipoprotein,LDL)等水平顯著升高；肝臟TC、TG 和FFA 等水平顯著升高；肝細胞明顯水腫，胞漿內出現大小不等的脂滴，呈肝細胞脂肪變性，偶見肝細胞點狀壞死或炎癥等。

2.1.1 高脂飼料誘發脂肪肝模型 高脂飲食誘導的NAFLD 模型在發病機制上與人類NAFLD 最相似，且多合并肥胖、胰島素抵抗及其他代謝綜合征的組分。高脂飲食構造原理基本一致(增加游離脂肪酸的攝取或合成)，主要差別在于飲食中脂肪比例不等(10%～71%)，含或不含高碳水化合物。有研究表明脂肪含量占28%以上的飲食可使動物出現肥胖[3]。在普通飼料中添加豬油或花生油等高脂肪含量物質，可促進過氧化反應發生，產生自由基和醛類物質，醛類物質可與抗氧化劑的活性部位結合，減少自由基的清除，加速NAFLD 的形成。Aragno 等[4]采用普通飼料添加15%豬油和4%膽固醇飼養大鼠15 周，生化指標顯示模型組大鼠體重、肝指數、肝臟TG、TC、FFA、LDL 水平均顯著高于對照組，肝臟病理學切片顯示模型組大鼠肝臟脂肪沉積明顯增加。高思源等[5]采用高脂飼料喂養大鼠并結合慢性應激，12 周后發現肝臟水溶性總膽固醇、三酰甘油含量明顯升高，肝臟LXRα、PPARγ mRNA 表達進一步下調，血皮質醇濃度升高，用此方法建立NAFLD 模型的過程可能更接近于人類NAFLD 病人的發病過程。高脂飼料誘發脂肪肝模型所用飼料的營養結構與西方人群的飲食結構類似，都是以動物脂肪為主要的能量來源，可以作為模擬西方人群脂肪肝疾病的動物模型。

2.1.2 高碳水化合物誘發脂肪肝模型 在普通飼料中添加蔗糖或玉米粉等高糖高淀粉含量物質，可增加長鏈脂肪酸的合成而使TG 的合成增加，并且當血糖升高時，NADPH 供應充分，使乙酰輔酶A 轉變成的膽固醇增加。在Wistar 大鼠的飲用水中加入10%蔗糖，48 h 內即能在其體內觀察到脂肪酸合成增加。SD 大鼠經含糖量極高(蔗糖70%)的飲食喂養后出現肥胖，2～3 周可形成脂肪肝，伴參與脂肪合成的酶類及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成增加[6]。Fu等[7]采用普通飼料添加15%玉米粉和3%膽固醇飼養大鼠12 周，生化指標顯示模型組大鼠肝臟TC、TG 水平，血清TC、TG 和LDL 水平顯著高于對照組。肝臟病理學切片顯示模型組大鼠肝細胞內出現大泡性和小泡性脂肪變性。該模型所用飼料的營養結構與東方人群的飲食結構類似，都是以糖類為主要的能量來源，可以作為模擬東方人群脂肪肝疾病的動物模型。

上述兩種模型操作方法簡便，價格低廉，重復性好，實驗動物死亡率低，對實驗人員無毒，病變過程與人類脂肪肝形成過程類似，病變后逆轉緩慢適合藥物干預治療，是國內外常用的脂肪肝模型。但是造模時間長，實驗動物易產生厭食、腹瀉等不良反應。

2.1.3 膽堿-蛋氨酸缺乏(Methionine-Choline Deficiency， MCD)飲食脂肪肝模型 MCD 飲食脂肪肝模型是由美國Harlan Teklad 實驗室開創[8]。膽堿又稱為VitB4，是卵磷脂、乙酰膽堿等物質的組成成分。當缺少膽堿時，肝臟合成磷脂減少，不能有效地合成脂蛋白, 特別是極低密度脂蛋白(VLDL)；而VLDL 是運輸內源性甘油三酯出肝的主要形式，從而使甘油三酯在肝臟內積聚，迅速沉積，形成脂肪肝。積累在肝的甘油三酯代謝生成甘油二酯，膽堿與甘油二酯生成卵磷脂減少會導致甘油二酯積累，結果細胞膜中的卵磷脂會被代謝以提供膽堿，引起肝細胞膜損傷[9]。MCD 飲食喂養的嚙齒類動物，肝組織出現腺泡3 區嚴重脂肪變，隨后見到以淋巴細胞和多形核白細胞浸潤為主的壞死性炎癥，進一步發展形成細胞周圍及中央靜脈周圍纖維化[10]。George 等[11]采用MCD 飲食飼養大鼠17 周，肝臟病理學切片顯示模型組大鼠肝臟2 周后出現輕微脂肪變性，5 周后出現大泡性脂肪變性、炎癥細胞浸潤和肝小葉病變。該模型是經典的非酒精性脂肪性肝炎動物模型，操作方法簡便，造模時間短，應用極為廣泛。但是MCD 飼料價格昂貴，且人類肝臟不含膽堿氧化酶，不存在膽堿缺乏問題，所以該模型的發病機制與人類完全不同，它最大的缺點是缺乏人類NAFLD 所具有的胰島素抵抗。目前，該模型主要用于脂肪肝治療藥物的篩選，并可為非肥胖而伴NAFLD 等特殊脂肪營養障礙疾病提供研究思路。2.1.4 全腸外營養(TotalParenteralNutrition,TPN) 脂肪肝模型 TPN 是由賓夕法尼亞大學的Dudrick 在1968 年首次臨床報道[12]，成年Wistar 大鼠深靜脈插管，電腦輸液泵將營養液以3 mL/h 的速度持續滴注，當腸外營養液中非蛋白能量達到33%以上或總攝入量占總熱量83%以上時，1 周后大鼠肝臟即出現明顯的脂肪變性，主要是由于甘油三酯積聚所致，此外，尚存在血清VLDL 明顯降低，提示肝臟分泌甘油三脂受抑。Ling 等[13]采用TPN 造模4 d，生化指標顯示模型組大鼠血清C- 反應蛋白(C-Reactive Protein，CRP) 和肝臟TG 水平均顯著高于對照組，血清TG 水平顯著低于對照組。該模型造模時間短，形成率高，但是由于操作方法復雜，限制了該模型的推廣應用。

2.2 藥物中毒性脂肪肝模型 藥物或化合物作用引起肝臟脂肪變性，使肝細胞脂質成分的合成和(或)攝入增加，或釋放和代謝減低，均能使脂肪在肝細胞內堆積，甚至常常為多種機制同時參與、協同促進脂肪變性的發生。以下兩種模型操作方法簡便，造模時間短，形成率高，但呈急性病變過程，與人類脂肪肝的發病機制和病理生理學改變有著本質的區別，由于藥物具有較大的毒性，實驗動物死亡率高，且對實驗人員有一定的毒性。

2.2.1 四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)脂肪肝模型 CCl4是最早采用的實驗性脂肪肝模型誘導劑。主要機制可能與CCl4誘導CYP2E1 激活及嚴重脂質過氧化反應造成肝細胞結構和功能破壞有關[14]。Fang 等[15]采用2 mL/kg CCl4灌胃，一周2次，持續8 周，生化指標顯示模型組大鼠肝臟腫大率達185，TG、MDA 水平顯著高于對照組。

2.2.2 乙硫氨酸脂肪肝模型 灌胃給予雄性Wistar大鼠乙硫氨酸0.25 g/kg，48 h 后血清三酰甘油、總膽固醇、脂蛋白減少，血清酶輕度升高，肝內三酰甘油含量明顯升高，病理表現為肝細胞肥大，肝竇消失，肝細胞核旁胞漿空殼，部分形成明顯脂滴，偶見炎性細胞浸潤，無明顯壞死及纖維化[16]。Furuhama等[17]在大鼠飲食中加入0.25%的DL-乙硫氨酸，持續2 周，生化指標顯示模型組大鼠血清谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT) 和總膽固醇含量顯著升高，肝臟病理學切片顯示模型組大鼠肝臟出現嚴重的脂質沉積和纖維化。

2.3 特殊品系脂肪肝模型 特殊品系脂肪肝大鼠是一類由人工選育的，可先天或自發形成脂肪肝，無需后天給藥或調整飲食結構的動物模型。以下兩種模型可用于并發代謝綜合征的脂肪肝的研究，而不適用于后天營養失調所致脂肪肝的研究。特殊品系大鼠來源較為稀少，價格昂貴，且死亡率較高，僅適于特定病理機制的研究。

2.3.1 遺傳性肥胖Zucker 大鼠 遺傳性肥胖Zucker 大鼠是一種著名的并得到廣泛應用的遺傳性肥胖病模型，可發生高胰島素血癥、胰島素抵抗而自發形成糖尿病、肥胖和脂肪肝。Flamment 等[18]證明遺傳性肥胖Zucker 大鼠的體重、肝臟重量、肝臟TG 含量、血糖、胰島素、瘦素、脂聯素水平均明顯高于普通Zucker 大鼠。

2.3.2 BHE 大鼠 BHE 大鼠是一種生后300 d 自發形成糖耐量異常，血糖、血脂顯著升高，形成高脂血癥、脂肪肝，但無肥胖的特殊種系[19]。該品系主要用于2 型糖尿病的研究，作為脂肪肝模型應用并不廣泛。

3 NAFLD 模型研究展望

一個理想的動物模型符合以下標準：（1）發病特征與人類脂肪肝病變特征相似；（2）病變有一定發展過程；（3）形成率高，死亡率低，可控性強，重復性好；（4）造模方法簡便易行，價格低廉。在上述幾種非酒精性脂肪肝模型中，采用高脂飼料誘導的脂肪肝模型因其操作方法簡便，價格低廉，重復性好，死亡率低，是國內外最常用的造模方法。但是由于人體機體功能的復雜性和實驗動物種族差異性，以及動物年齡、飼料配方、造模時間以及模型判定指標等方面仍缺乏相對統一標準，使任何一種實驗動物模型都不能全面模擬人類非酒精性脂肪肝的演變過程，無法準確地反映脂肪肝疾病的本質，難以滿足所有脂肪肝疾病的科研需要，因此，建立一個能完全反映人類脂肪肝的動物模型比較困難。總之，不同造模方法所形成的脂肪肝模型在發病機制和病理改變等方面具有本質的差別，需根據實驗研究目的的不同，選擇符合人類脂肪肝形成過程及病變特征、造模時間短、動物死亡率低、重復性好、操作方法較簡便的動物模型進行相關研究。

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