肝纖維化的動物模型制備研究

王曉麗

(臨汾職業技術學院，山西 臨汾 041000)

肝纖維化是許多無關損傷病因的慢性肝病的一個典型的結果。它來自生理傷口愈合反應的連續輪回或長期激活，從而維持了持久性纖維形成，最終導致器官的漸進纖維化［1］。為研究肝纖維化，評估治療方法和策略的抗肝纖維化效果，幾十年來動物模型一直都在被使用［2］。該領域(纖維化動力學，基質生成細胞、主要機制和纖維化相關胞內信號通路的識別，基質重塑和纖維化可逆性的概念和機制……)的重大進展都來自動物模型的研究，來自實驗結果與臨床資料的對比。

1 肝纖維化的體內研究模型

動物模型可進行的研究包括:a)在人類研究中不能被解決的問題而需要復雜而全面的研究;b)在疾病演化與回歸的關鍵時刻進行多次采樣;c)實驗測試的變量數可以保證科學試驗要求的最低限度。與體外模型相反，整個器官是完整的(不同類型的細胞和基質之間的相互作用)，也是一個活體的一部分，神經、內分泌、神經內分泌、循環系統、飲食、腸源性等等，這些因素的影響也能得到兼顧［2］。

動物模型的缺點是在動物身上復制人類疾病，他們在免疫反應、基因表達/調控、代謝、藥理或組織反應等方面與人體有大的種屬差異［3］。在動物模型中的纖維化誘導刺激的選擇根據的是研究者的想法，期望與動物反應相聯系起來的發病機制能夠類似于那些發生在人類相關疾病的機制。這種想法在某種情況下可能是自欺欺人、一廂情愿的。為人類疾病提供一個完美的模擬、涉及相同的致病因素和病理生物學過程(包括免疫/炎癥反應)，病理和疾病重現性達到與人體相同的結果，這對于任何動物模型而言，幾乎不可能。因此，把在動物模型觀察到的結果應用到臨床上時必須格外小心。

雖然動物模型對理解病理生理過程具有巨大的價值，但他們是模型的本質沒有發生改變，他們不能重復再現真正的人類疾病。所以說，每一個模型(包含目標、設計、株系和物種)顯示纖維化的發病機制、局部解剖和演化都有自己獨特的特點。在使用一個動物模型之前，首先必須考慮的一般概念，如可重復性(一個通用時間框架內，動物部分達到預期的狀態)，特異性(即模型應該具有所需的異常，沒有任何其他的并發癥，如果這樣的并發癥確實存在，它必須具有典型性和可重復性)和可行性(實驗室是否具備相應的專業知識、人力、設備、經特定訓練的從事模型構建或處理的人員)。纖維化發生被激活，但纖維化的特異性觸發與調控機制是取決于動物實驗所需的模型、設計、物種和品系，而事實上的確如此，不同的動物模型，其纖維化的模式大不相同。

纖維化模型首先在大鼠被開發，后來因為小鼠遺傳學的優勢而采用小鼠。在實驗中當大小是一個問題時，例如實驗需要進行成像技術或血流動力學測量時，大鼠可能會占有一定的優點。在一些研究中，狒狒和黑猩猩已被分別用來研究酒精誘導和病毒性肝炎。

在測試一個潛在的抗纖維化劑的功效研究中，一般認為藥物應在至少兩個動物模型中進行［4］。關于使用這些模型的一個至關重要的問題是，它們的使用應注意匹配潛在抗纖維化劑的作用模式。在選擇可用的治療模型時，應該首先考慮人群中肝損傷的起始病因。當肝損傷的起始病因不能被處理和/或纖維化進展為肝硬化時，使用動物模型必須確保抗纖維化劑不影響用來產生肝臟損傷的實驗劑的肝毒性，也就是說，如果使用四氯化碳肝纖維化模型，該抗纖維化劑不能是一個CYP2E 的抑制劑［5］。否則纖維化的減少可與肝臟損害的水平降低有關，而不是由于抗纖維化劑的作用。

在肝纖維化的基本機制和測試新的抗肝纖維化藥物研究中，以前開發的各種動物模型已經發揮了重要功能［6］，但必須認識到，與人的“對應體”相比，它們都表現出一定的顯著的形態差異。至少膽汁淤積模型是這樣，特別是常見的膽管結扎，其纖維化的圖式與人的膽汁流動中斷的癥狀是非常相似的。另一方面，常用的四氯化碳模型可能是研究纖維化和肝硬化回歸的最常用工具，但與大多數人類肝硬化相比，癥狀中的纖維隔卻很少能在動物中觀察到，即使在長期的四氯化碳誘導下，也是如此。人類和動物模型疾病之間最重要的區別之一可能是后者缺乏血管相關的顯著改變，人類的肝硬化往往是通過二次缺氧事件摻入了肝細胞的損失，導致肝實質結構的消失。這個現象不會發生在常用的動物模型中。

2 肝纖維化的體外模型研究

至目前為止，雖然抗肝纖維化藥物研究的發展主要依靠體內動物實驗，但是體外模型在研究肝纖維化發展中所涉及的機制方面則更具有優勢［3］。實驗動物模型一個重要的缺陷在于這些模型在很大程度上僅限于嚙齒類動物，由于種間差異，這些模型提供的人類疾病和藥物毒性導致纖維化的預測值可能是有限的。另外，從動物倫理角度出發，纖維化的體內模型給實驗動物造成很大的傷害，因此，應盡可能地避免使用動物。體外模型的主要優點在于它是使用人體細胞或組織，可以解決物種的差異，其結果與人的疾病機理能有更高的相關性。

肝臟中纖維化的發展是一個多細胞過程，意味著不同的細胞類型涉及這個結果。肝臟中參與肝纖維化發展的許多類型的細胞已經得到確認［7］。簡單地說，受損的肝細胞(主要是受損的肝實質細胞)，產生多種介質，如活性氧和促纖維化細胞因子，啟動肝星狀細胞(HSC)和/或其他促纖維化細胞的活化和增殖，生產過量的細胞外基質(ECM)［8］。ECM 沉積增加主要原因是活化的HSC 生產基質蛋白的增加。ECM 積聚及其蛋白質組成的深刻變化，反過來又可以進一步促進HSC 的活化和增殖，從而加劇纖維化的進展［7］。

如上所述，在細胞水平上，肝星狀細胞被認為是肝纖維化發展中的關鍵角色。因此，體外肝纖維化模型中最常用的是靜態肝星狀細胞的分離及其在塑料培養皿含血清培養基中的培養。在這些條件下，細胞開始一個表型轉分化的過程，該過程與響應于慢性肝損傷的肝臟中出現活化肌成纖維細胞表型的過程類似，特別是當培養基中存在Kupffer 細胞時(作為次要的雜質)［9］。一旦細胞激活為肌成纖維細胞的表型，細胞在隨后的傳代中仍保持肌成纖維細胞表型。在可能的情況下，細胞檢查應在原初代培養中使用，因為這期間是唯一來檢查轉分化的影響時間。

需要注意的是，實驗室方案的差異可能會導致在肝肌成纖維細胞性質的差異，或肝星狀細胞衍生的肌成纖維細胞可能會被匯管區肌成纖維細胞的生長所代替［8］。而且目前沒有靜態肝星狀細胞群的公認診斷標志物，可用于確認細胞的特性和純度。盡管如此，體外培養系統將仍然是一個寶貴的工具，用于研究肝纖維化，可以很容易地用于高通量篩選實驗來檢測潛在的抗纖維化藥物。

一個技術上更具挑戰性的體外模型是肝臟切片的培養［10，11］。從正常或病變的肝臟得到的肝片將保留其原生的細胞外基質、細胞與細胞的接觸和細胞密度，這是一個有價值用于短期研究的模型。然而，即使是最薄的組織切片(約200 μm厚，10 個細胞厚)要保證營養能夠有效地到達薄片組織的大部分細胞，特別是肝細胞，也是很難的，所以一般在培養24 h 后死亡［12，13］。

嚙齒動物來源的肝星狀細胞很容易地培養許多代，因此，如果只是研究促纖維化狀態的肌纖維母細胞，永生細胞株往往不是必需的。要研究自靜止狀態開始的轉分化過程，細胞需要反復從動物中分離，因為肌成纖維細胞不容易恢復到靜止狀態。嚙齒類動物的肝星狀細胞株的價值在于它們容易被構建質粒轉染。大多數實驗室直接進行人體實驗很困難，所以使用人肝星狀細胞系是比較常見的。此外，大多數人的肌成纖維細胞傳代培養2 ～5 代后，便出現衰老(58 份來自人的培養樣品，只有2 份樣品能夠傳代培養5 代以上)。部分原因可能是分離的細胞主要來自老年患者(主要是從患有肝臟繼發性腫瘤的患者得到的部分肝切除標本)。

人類肌成纖維細胞對轉染也有一定抵抗，對于一系列報告基因的構建質粒，只有核轉染才足夠有效［14］。病毒載體已被證明在感染細胞方面具有較高的效率，這些載體包括腺病毒［15，16］，逆轉錄病毒［17］與桿狀病毒［18］。雖然報告證實它們是有效的，產生重組載體所需資源的缺乏可能是導致它們難以得到廣泛使用的原因。

目前，體外模型系統仍然是一個有效來篩選大量潛在化合藥物的方法，尤其是在早期階段，為藥物調節纖維化過程的能力提供各種靶點。然而，很多體外系統也有局限性，這些局限阻礙了對于抗纖維化劑的識別，不能達到100%的準確性。體外系統是一個封閉孤立的人工體系，不能像整體研究一樣，可以研究藥物的吸收，分布，代謝和排泄。在體內肝肌成纖維細胞緊挨機體的主要藥物代謝細胞，但是體外系統缺乏這些。因此，仍需要將體外模型更換為體內動物模型來做進一步的研究，體內動物模型在肝纖維化的研究中發揮著無可替代的作用。

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