艾灸頭部組穴對VD大鼠腦內VEGF及其受體Flt-1、Flk-1 mRNA表達的影響*

王 頻楊 駿張慶萍石海平馬 嵐

（1.安徽中醫學院，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫學院第一附屬醫院，安徽 合肥 230038）

艾灸頭部組穴對VD大鼠腦內VEGF及其受體Flt-1、Flk-1 mRNA表達的影響*

王 頻1楊 駿2張慶萍1石海平2馬 嵐1

（1.安徽中醫學院，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫學院第一附屬醫院，安徽 合肥 230038）

目的 觀察艾灸頭部組穴治療血管性癡呆（VD）大鼠皮層、海馬內VEGF及其受體Flt-1、Flk-1 mRNA表達，研究艾灸調控VD腦內血管新生機制。方法 選取Wistar雄性老年大鼠，四血管阻斷法制備大鼠VD模型，電腦隨機數字表法隨機分為艾灸組、西藥組、模型組，另設假手術組對照。艾灸組取百會、大椎、神庭穴艾灸治療，西藥組茴拉西坦灌胃共2個療程。神經行為學評分并結合跳臺儀檢測治療前、第2療程后學習記憶成績；RT-PCR檢測各組大鼠皮層、海馬內VEGF及其受體Flt-1、Flk-1 mRNA的表達水平。結果 經2個療程治療后，動物跳臺實驗的潛伏期、錯誤次數，以及神經行為學評分，艾灸組、西藥組與模型組均有非常顯著差異，表明艾灸、西藥在提高VD大鼠潛伏期，降低VD大鼠錯誤次數以及對神經行為學評分影響均有明顯療效，且艾灸組明顯優于西藥組。與模型組相比，艾灸組皮層內VEGF及其受體Flt-1 mRNA的表達有明顯差異，海馬內VEGF及其受體Flk-1 mRNA的表達有顯著差異；而西藥組僅顯示海馬內VEGF或皮層Flt-1表達上調，沒有觀察到同一腦區VEGF及其受體同步明顯表達。結論 艾灸在改善VD大鼠學習記憶成績、神經行為學評分的同時，通過調控VEGF及其受體Flt-1、Flk-1 mRNA的表達水平，促進了要害部位的血管生成，并最終激發了腦內神經的損傷修復機制。

血管性癡呆 艾灸 血管生成 VEGF Flt-1 Flk-1

血管性癡呆（vascular dementia，VD）臨床表現以神經系統定位損害的癥狀和體征為主。該病的發生與皮層病變，尤其是左側皮層缺血及丘腦、海馬的缺血性改變密切相關［1］。本課題組多年的臨床經驗證明，艾灸治療該病有一定的療效［2-4］，但機制尚不明確。本研究采用動物實驗的方法，檢測艾灸對VD大鼠要害部位皮層、海馬內促進血管生成的關鍵因子血管內皮生長因子（VEGF）及其受體fms樣酪氨酸激酶-1（fms-like yrosine kinase-1，Flt-1）、血管內皮細胞生長因子受體2（Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2/Flk-1）的表達，探討艾灸治療VD的促進血管生成機制，為該病治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物專用清艾條（6 mm×100 mm）由安徽中醫學院附屬醫院中藥制劑室加工；茴拉西坦膠囊（0.1 g×30片/瓶，無錫市凱西藥業有限公司生產）；大鼠跳臺儀，北京中國中醫科學研究院提供；VEGF、Flt-1、Flk-1引物由上海生工生物技術有限公司合成；RTPCR兩步法試劑盒購自上海生物工程公司；TRIzol由美國Vitrogen公司提供。

1.2 動物與分組SPF級雄性Wistar大鼠60只，體質量（300±30）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2009-0005。用跳臺實驗對動物進行篩選，篩除訓練過程中反應過于敏感或遲鈍的大鼠后進行下一步實驗。電腦隨機數字表法產生8只作為假手術組，其余大鼠復制VD動物模型，模型復制后4 d用跳臺實驗結合潛伏期成績測試再次篩選模型成功大鼠并保留36只，隨機分為艾灸組、西藥組、模型組，每組12只。

1.3 模型制備采用改良的Pulsinelli’s四血管阻斷（4VO）VD 動物模型［5］。 大鼠于術前 8～12 h 禁食，不禁水。10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，俯臥固定大鼠行背側頸正中切口，逐層鈍性分離組織，暴露雙側第1頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側翼小孔內的椎動脈，造成永久性閉塞。次日再將大鼠仰臥固定，行腹側頸正中切口，鈍性分離雙側頸總動脈，用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈10 min，間隔1 h后再夾閉10 min，共3次。頸總動脈夾閉2 min內瞳孔不散大者棄之。局部傷口縫合前均以慶大霉素處理防止感染。假手術組大鼠不熱凝椎動脈，不夾閉頸總動脈，其他手術進程同模型組。在全部造模過程中保持動物肛溫在37℃左右。造模同時采用跳臺實驗檢測動物的學習記憶成績。訓練及測試時將動物置于內，適應3 min，熟悉環境，開始測試時將大鼠放在測試平臺上，并開始計時，直到第一次跳到銅柵上所需時間記為潛伏期，5 min內從跳下銅柵再跳回平臺上的次數算作錯誤次數，潛伏期和錯誤次數作為測學習試成績。分別在造模前后測試VD大鼠學習記憶成績，評定VD模型的成功。在治療前、第2療程后測試評判療效。初次神經行為學評分在模型復制后4 d進行。治療后評分在艾灸組和西藥組第2療程末次治療結束后6 h進行。模型組評分與之平行。評分標準按Zea Longa等［6］制定的6級評分法改進：0分為無功能障礙；1分為不能伸展前肢；2分為向一側旋轉；3分為向一側傾倒；4分為無自主活動伴意識抑制；5分為死亡。評分為1～4分則缺血損傷造模成功。

1.4 治療方法艾灸組大鼠固定于自制的鼠板上，特制的大鼠頭部固定器固定大鼠頭部，保持其清醒狀態下，選取百會穴、大椎、神庭穴剃毛點記，穴位的選取參照大鼠的穴位圖譜，按照人體穴位的定位方法并參照大鼠骨骼與體形確定。用專用清艾條懸灸20 min。每日1次，15次為1療程 ，共治療2療程，療程之間休息1 d，常規飼養。西藥組采用茴拉西坦灌胃治療。根據人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表計算給藥劑量。灌胃劑量為0.0625 g/kg體質量，蒸餾水混合成0.01 g/mL質量濃度的溶液，每日1次，療程與艾灸組相同。假手術組和模型組與灸法實驗組平行，但只作鼠板上固定而不作其他處理。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 標本采集 艾灸組、西藥組大鼠在兩個療程結束后，并在跳臺實驗完成后進行腦組織取材。將大鼠10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，用咬骨鉗夾斷頸椎上端，剪開大鼠頭部皮毛，血管鉗仔細剝離大鼠頭骨，使其整個腦部充分暴露，鈍性分離血管神經及軟組織織，取出大腦并將其輕置在DEPC擦拭的冰袋上，小心剝離海馬并迅速取組織100 mg置凍存管液氮保存；將左側腦組織自額葉至枕葉分為4等份A、B、C、D，迅速取B腦片皮質100 mg置凍存管 ，液氮保存備用。

1.5.2 RT-PCR方法 引物設計參考Genbank核苷酸序列資料，VEGF 正義鏈引物：5＇-GCTCTCTT GGGTGCACTGGA-3′， 反義鏈引物：5′-CACCGCCTTGGCTTG TCACA-3′，635 bp；Flt-1 正 義 鏈 引 物 ：5＇-TCATGCAAGCGGGCCAGACTCTCTTTC-3′， 反義鏈引物：5′-ATCT-CACGGGGCTCGGCGGGCTTATTT-3′，600 bp；Flk-1 正 義 鏈 引 物 ：5′-CATTGTGTCC-TGCATC-CGGGATAACCT-3′， 反義鏈引物：5′-TGTACACGATGCCATGCTCGTCAC-TGA-3′，600 bp；β-action 正義鏈引物：5′-AACCCTAAGGCCAACCGTGAA-3′，反義鏈引物：5′-TCATGAGGTAGTCGTTCAGGT-3′，265bp。

1.5.3 組織總RNA的提取 按TRIzol試劑說明書操作提取標本總RNA，并溶解于20 μL去RNA酶的滅菌雙蒸水（DEPC處理ddH2O），經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并測定A260/A280，比值應在1.8～2.0之間，確定樣品純度，其余放在冰箱中保存備。

1.5.4 cDNA的合成與產物分析 嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書進行操作。取5 μL反應產物在 2%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，通過紫外線凝膠成像分析系統對擴增產物條帶進行分析，分別測定各擴增帶吸光度，作為其mRNA水平的半定量指標。計算公式：吸光度比值=（VEGF、Flt-1、Flk-1擴增產物的光密度值/參照系統β-action擴增產物的光密度值）×100%。

1.6統

計學處理應用SPSS12.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，數據先進行方差齊性檢驗（檢驗水平α=0.10）。進行單因素方差分析，兩兩比較選用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1造模后4 d神經行為學評分及學習記憶成績測試結果造模4 d后，8只假手術組大鼠潛伏期為（184.2±61.56）s明顯高于造模大鼠（39.18±14.45）s（P＜0.01）。同時假手術組大鼠錯誤次數為（1.85±0.73）次，明顯低于造模大鼠（6.06±1.15）次（P＜0.01）。 造模后模型組大鼠神經行為學評分為（2.83±0.78）分。表明VD模型大鼠的學習記憶成績顯著低下，VD造模成功。

2.2治療后各組神經行為學評分及學習記憶成績測試結果比較見表1。經方差分析，各指標3組間均有非常明顯差異（F=40.53，F=46.30，F=22.83）。 與模型組相比，艾灸組及西藥組的潛伏期、錯誤次數及神經行為學評分均有非常明顯差異（P＜0.01）。艾灸組與西藥組比較，潛伏期、錯誤次數及神經行為學評分有明顯差異（P＜0.01或0.05）。表明艾灸、西藥治療均有效。而艾灸組潛伏期大于西藥組，錯誤次數及神經行為學評分均小于西藥組，艾灸治療效果明顯優于西藥治療。說明經兩個療程治療后，艾灸、西藥在提高VD大鼠潛伏期，降低VD大鼠錯誤次數及神經行為學評分方面效果顯著，而艾灸組優于西藥組。

表1 各組大鼠治療后潛伏期、錯誤次數及神經行為學評分結果比較（±s）

表1 各組大鼠治療后潛伏期、錯誤次數及神經行為學評分結果比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n 神經行為學評分（分）潛伏期（s） 錯誤次數（次）艾灸組 12 1.82±0.24**△西藥組 12 2.03±0.22**141.40±21.60**△△ 2.11±0.37**△△105.74±18.75** 3.36±0.46**模型組 12 2.58±0.37 69.22±18.41 5.73±1.51

2.3各組治療后皮層VEGF mRNA、Flt-1 mRNA、Flk-1 mRNA表達檢測結果比較見表2。經過兩個療程治療后，3組間皮層內VEGF及其受體Flt-1 mRNA表達的檢測結果有明顯差異，Flk-1 mRNA表達無明顯差異。與模型組相比，艾灸組VEGF、Flt-1 mRNA的表達有極顯著差異（P＜0.01），西藥組僅Flt-1 mRNA的表達有顯著差異（P＜0.05），而 VEGF、Flk-1 mRNA表達無明顯差異。與西藥組相比，艾灸組VEGF、Flt-1 mRNA的表達明顯提高 （P＜0.01），而兩者間Flk-1 mRNA表達無差異。3組間海馬內VEGF及其受體Flk-1 mRNA表達的檢測結果有顯著性差異 （F=38.72，F=30.35），Flt-1mRNA 表達無差異。與模型組相比，艾灸組VEGF、Flk-1 mRNA的表達增強，有顯著差異 （P＜0.01）， 而西藥組僅VEGF的表達上調 （P＜0.01），其兩個受體 Flt-1 mRNA、Flk-1 mRNA 表達無明顯差異。與西藥組相比，艾灸組海馬內VEGF、Flk-1 mRNA的表達水平較高，有非常顯著差異（P＜0.01），而兩者間Flt-1 mRNA表達差異無統計學意義。

表2 各組皮層及海馬內VEGF mRNA、Flt-1 mRNA、Flk-1 mRNA 表達比較（±s）

表2 各組皮層及海馬內VEGF mRNA、Flt-1 mRNA、Flk-1 mRNA 表達比較（±s）

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3 討 論

近年來發現，VEGF在缺血缺氧性損傷疾病中發揮著重要的作用，具有保護內皮細胞，加速毛細血管再生，阻止神經細胞凋亡，刺激神經元軸突的生長，調節血管干細胞的分化、調節神經干細胞增殖分化等多方面作用［7-9］。VEGF在正常腦組織中僅有少量表達，在腦缺血發生后，低氧作為一種信號激活VEGF及其受體系統，促使VEGF表達升高，尤其在海馬、皮層等對缺血敏感的區域。VEGF促新生血管生成作用是通過靶細胞上的相應受體介導的，VEGF與其受體Flt-1、Flk-1結合后，具有促進內皮細胞增殖和遷移的作用，從而加速新血管的形成。VEGF受體家族Flt-1和Flk-1，在促新生血管生成過程中，具有各自特異的生物學特性，研究發現由Flt-1介導的信號轉導系統中，由于缺乏絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）相關途徑，其生物學效應更多表現為誘導內皮細胞的遷移，而促內皮細胞增殖作用不明顯，但刺激神經干細胞增殖作用顯著［7，10］，有利 于 缺血損 傷后的 神經修 復 。 VEGFR-2（Flk-1）介導的信號轉導通路中存在完整的絲裂原活化蛋白激酶相關途徑，其生物效應表現為細胞形態學改變，包括肌動蛋白的改組，細胞膜皺縮，趨化性和促有絲分裂能力顯著［11］，因此促內皮細胞增殖作用明顯。

本研究在多年的臨床經驗基礎上，取頭部的百會、大椎、神庭艾灸治療，以臨床常規益智類藥物茴拉西坦為對照，經2療程治療，VD大鼠神經行為學評分及學習記憶成績測試，均出現了不同程度改善，驗證了艾灸治療VD的療效優于茴拉西坦。觀察VD腦內要害部位左側皮層、海馬內VEGF及其受體Flt-1、Flk-1 mRNA的表達，結果發現，艾灸的療效取得與VD皮層、海馬內VEGF及其受體Flt-1、Flk-1 mRNA的表達正相關，并存在著皮層內VEGF/Flt-1同時上調和海VEGF/Flk-1馬內 同時上調的信號機制。而西藥組臨床指標的改善與其腦內VEGF及其受體Flt-1、Flk-1 mRNA的表達的關系不夠密切，盡管海馬內VEGF表達也發生了較顯著上調，但其受體Flt-1、Flk-1表達沒有顯著性差異，介導的信號轉導機制不明確。因此根據本研究結果謹慎推測，艾灸在改善VD大鼠學習記憶成績、行為學評分同時，可能存在著艾灸調控VEGF及其受體Flt-1、Flk-1mRNA的表達水平，促進了要害部位的血管生成，并最終激發了缺血損傷后的神經修復。機對照試驗［J］.中西醫結合學報，2010，8（7）：636-640.

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1mRNA Expression

Objective:To observe the expressions of VEGF，flt-1，Flk-1mRNA within the hippocampous and cortex of the vascular dementia （VD）rats and to study the mechanism of angiogenesis of the treatment by moxibustion.Methods:Wistar health elderly male rats was selected.4-vessle occlusion was used to prepare the vascular dementia model.The model rats was dIvided into 3 groups by the digit schedule such as the moxibustion group，the western medicine group ，the model group.The sham operated group was set to contrast.the moxibustion group rats treated by moxibustion on the point of baihui（GV20），shenting（GV14） and dazhui（GV24）.The western medicine group rats was treated with Aniracetam for 2 courses.step-down avoidance test，nerve behavior test and nervial behavior scores were implemented before the treatment and after the 2 courses treatment，respectively.And test the expression level of VEGF，flt-1，Flk-1mRNA within the hippocampous and cortex of the rats after the treatment in RT-PCR ways.Results:After 2 courses treatment，the test scores in latent period ，error times and nervial behavior scores showed that the moxibustion group and the western medicine group had significant difference compared with model group.The moxibustion group got better than the western medicine group，which explain that the moxibustion group and the western medicine group had their own treatment effect in curing VD but the moxibustion group had more effective.Statistics of the level of VEGF，flt-1，Flk-1mRNA that the VD rats hippocampus and cortex positive cells expressed showed that the moxibustion group had significant difference compared with model group but the western medicine group had no significant difference.the moxibustion group got the higher level of VEGF，flt-1，flk-1mRNA than western medicine group too.These all showed that the moxibustion was more effective in increasing the positive cells expression within the VD rat hippocampus and cortex，and the western medicine had no similar effect in curing VD.Conclusion:Moxibustion has the effect in improving behavioral score and memory performance in VD rats，and it maybe exist the mechanisms of control ex-pression level of VEGF，flt-1，Flk-1mRNA within the hippocampous and cortex.In particular，the moxibustion raise the key factor VEGF，lt-1 Flk-1mRNA expression，and promote angiogenesis in the vital parts，and ultimately stimulate mechanisms of repairation of brain nerve njury.

WANG Pin1，YANG Jun2，ZHANG Qing-ping1，et al.1 Anhui University of TCM ，Anhui，Hefei 230038，China；2 The First Affiliated Hospital of Anhui University of TCM，Anhui，Hefei 230038，China

Vascular dementia；Moxibustion；Angiogenesis；VEGF；Flt-1；Flk-1

R245

A

1004-745X（2013）06-0861-04

國家中醫藥管理局針灸學重點學科開放基金研究項目（2011zjxk007）；安徽省高等學校省級自然科學研究項目（kj2012z217）；安徽省自然科學基金項目（1308085MH173）

Moxibustion Head Acupoints on Vascular Dementia Rats Affection of VEGF and Its Receptor Flt-1，Flk-

2013-03-27）