止哮湯對(duì)支氣管哮喘大鼠模型ERK1/2表達(dá)的影響*

李竹英 王雪慧 劉文波 劉建秋△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

止哮湯對(duì)支氣管哮喘大鼠模型ERK1/2表達(dá)的影響*

李竹英1王雪慧1劉文波2劉建秋1△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

目的 觀察止哮湯對(duì)支氣管哮喘大鼠模型ERK1/2表達(dá)的影響，探討止哮湯治療支氣管哮喘的作用機(jī)制。方法 選取健康Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、地塞米松組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組。利用卵蛋白加氫氧化鋁復(fù)制哮喘大鼠模型，末次激發(fā)24 h后處死大鼠，HE染色后光鏡下觀測(cè)病理學(xué)變化，觀察免疫組化法檢測(cè)肺組織中ERK1/2的含量。結(jié)果 正常對(duì)照組ERK1/2呈陰性表達(dá)，模型組ERK1/2呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，強(qiáng)于正常對(duì)照組；地塞米松組、中藥各劑量組ERK1/2表達(dá)均弱于模型組；中藥低劑量組強(qiáng)于地塞米松組；中藥中、高劑量組則與地塞米松組無(wú)差異；中藥中、高劑量組均弱于中藥低劑量組；中藥高劑量組與中藥中劑量組表達(dá)無(wú)差異。結(jié)論 中藥止哮湯可下調(diào)哮喘大鼠肺組織中ERK1/2的表達(dá)，高、中劑量組療效較好，與地塞米松效果相當(dāng)。

止哮湯 支氣管哮喘 ERK1/2

氣道重塑可導(dǎo)致不可逆的氣道阻塞和持續(xù)性的氣道高反應(yīng)性，是目前難治性哮喘的重要病理基礎(chǔ)之一。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）通道是體內(nèi)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，通過(guò)介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，進(jìn)一步參與氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展。本研究旨在觀察止哮湯對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織ERK1/2表達(dá)的影響，闡述止哮湯治療哮喘的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠60只，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)，體質(zhì)量（230±20）g。實(shí)驗(yàn)前大鼠飼養(yǎng)在室溫23℃，黑夜和白晝各12 h的環(huán)境中，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)。取材前禁食12 h，但不禁水。

1.2 試藥與儀器雞卵蛋白 （OVA，GradeⅤ，美國(guó)Sigma公司，規(guī)格 1 g）。止哮湯中藥，組成：麻黃 12 g，川椒目 10 g，紫蘇子 10 g，半夏 10 g，紫菀 10 g，炙米殼3 g，細(xì)辛5 g，甘草3 g。地塞米松磷酸鈉注射液（1 mL，5 mg，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份公司）。4%甲醛、石蠟、乙醇、蘇木精、伊紅。濃縮型DAB試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司）及PV6001二步法免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）等。超聲霧化器（上海魚(yú)躍公司，A5253）；自制密閉有機(jī)玻璃箱 （50 cm×40 cm×25 cm）。

1.3 分組與造模60只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、地塞米松組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組共6組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組采用V級(jí)OVA制備模型，參照文獻(xiàn)［1］的方法略作改進(jìn)，分致敏和激發(fā)兩階段。分別于第1日和第8日腹腔注射共1 mL（含1 mg OVA和100 mg氫氧化鋁凝膠）無(wú)菌抗原液致敏，第14日后將動(dòng)物置于自制的密閉有機(jī)玻璃箱中，用霧化器將含1%OVA生理鹽水溶液霧化吸入，每日1次，每次30 min，連續(xù)定時(shí)激發(fā)共14 d。正常對(duì)照組用相同體積的生理鹽水代替OVA進(jìn)行致敏和激發(fā)。

1.4 給藥方法將止哮湯中藥湯劑煎煮成42.5、85、170 g/100 mL，根據(jù)人與大鼠給藥劑量比值1∶7，各劑量組分別予相應(yīng)劑量，按1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃。中藥各組在第2次致敏后第4日開(kāi)始給予中藥灌胃，激發(fā)階段則每次激發(fā)前1 h給予中藥灌胃。地塞米松組在第2次致敏后第4日開(kāi)始給予地塞米松（0.1 mg/100 g體質(zhì)量）灌胃，激發(fā)階段則每次激發(fā)前1 h經(jīng)腹腔注射地塞米松 （0.1 mg/100 g體質(zhì)量）。各組均于末次激發(fā)24 h后處死。

1.5 標(biāo)本采集及檢測(cè)于末次激發(fā)24 h后，將動(dòng)物用20%烏拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉，取右肺上葉置于甲醛中，HE染色后待測(cè)病理學(xué)變化。取左肺組織固定于4%多聚甲醛中，采用免疫組化方法（PV二步法）檢測(cè)檢測(cè)ERK1/2，用美國(guó)Universal Imaging Porporation的圖像分析系統(tǒng)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取3張，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，應(yīng)用Meta Morph軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞的光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以（±s）表示，組間比較用 t檢驗(yàn)。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多組間均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變正常對(duì)照組大鼠肺組織切片HE染色鏡下觀察：支氣管及血管周?chē)匆?jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、支氣管管壁增厚及面積增大，無(wú)氣道重塑現(xiàn)象。模型組大鼠肺組織鏡下觀察支氣管上皮水腫、增厚、脫落、結(jié)構(gòu)紊亂；杯狀細(xì)胞及黏液腺增加，黏膜下層和平滑肌增厚；氣道壁及氣道、血管周?chē)写罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，基底膜輕度增厚且形態(tài)不規(guī)則，支氣管平滑肌明顯肥大，支氣管管壁面積明顯增大。各治療組支氣管黏膜增生，黏液分泌亢進(jìn)，支氣管周?chē)辛馨图?xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增寬，部分有水腫，部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，經(jīng)組間比較，中、高劑量組與地塞米松組表達(dá)相當(dāng)，低劑量則表達(dá)強(qiáng)于上3組。見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠肺組織中ERK1/2表達(dá)見(jiàn)表1。

表2 肺組織ERK1/2表達(dá)圖像分析結(jié)果（±s）

表2 肺組織ERK1/2表達(dá)圖像分析結(jié)果（±s）

與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與地塞米松組比較，▲P＜0.05；與中藥低劑量組比較，#P＜0.05。

組 別 n正常對(duì)照組 10模型組 10地塞米松組 10光密度值10.53±2.27 45.96±5.21△23.75±3.69*中藥低劑量組 10 30.25±2.16*▲中藥中劑量組 10 23.12±4.37*#中藥高劑量組 10 22.63±5.61*#

3 討 論

氣道重塑的改變包括上皮細(xì)胞增生，杯狀細(xì)胞化生，氣道平滑肌 （ASM）的增生和沉積的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），而氣道重塑的概念也仍以組織學(xué)描述為主，氣道壁的增厚及氣道壁橫截面積增大，包括上皮下纖維化，平滑肌細(xì)胞的肥厚、增殖及黏液腺和杯狀細(xì)胞的增生及分化。研究認(rèn)為，這種不可逆性氣道狹窄主要由氣道平滑肌細(xì)胞異常引起：氣道平滑肌細(xì)胞持續(xù)受到胞外信號(hào)（如激動(dòng)劑、炎性遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子等）刺激后出現(xiàn)增生肥大和收縮，導(dǎo)致氣流受限。ERK1、ERK2在導(dǎo)致氣道平滑肌增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，Ras/Raf/ERK信號(hào)通路通過(guò)加快細(xì)胞周期、促進(jìn)DNA復(fù)制，從而使ASMC細(xì)胞增生［2］，從而參與到氣道重塑中。在多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子等刺激下ERK通路被活化，引起并調(diào)節(jié)氣道的上皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡、介質(zhì)及炎癥因子、基因的表達(dá)等而共同參與氣道重塑。

在本實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組ERK1/2呈陰性表達(dá)，而在模型組ERK1/2的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，顯著強(qiáng)于正常對(duì)照組（P＜0.05），提示ERK1/2信號(hào)通路在哮喘狀態(tài)下被激活，免疫組化圖片提示ERK1/2表達(dá)主要集中在支氣管平滑肌細(xì)胞的胞漿，證明了ERK1/2參與氣道重塑。模型組支氣管平滑肌層ERK1/2呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，光密度值均顯著高于地塞米松組和中藥各組，結(jié)合光鏡下哮喘大鼠肺組織支氣管及血管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)，表明在哮喘大鼠模型中存在著ERK1/2高表達(dá)，中藥各組ERK1/2表達(dá)均弱于模型組，組間比較提示中、高劑量組弱于低劑量組，而中、高劑量組則表現(xiàn)相當(dāng)，與HE染色鏡下觀察結(jié)果一致。地塞米松組ERK1/2表達(dá)較模型組明顯減輕，與中藥各組比較，弱于低劑量組，而與中、高劑量組相當(dāng)，表明止哮湯中、高劑量在治療大鼠哮喘模型中療效與地塞米松相當(dāng)，提示止哮湯可能是通過(guò)ERK1/2參與到治療氣道重塑中，起到部分抑制和逆轉(zhuǎn)氣道重塑的作用，從而達(dá)到治療哮喘的目的。

止哮湯在臨床中主要治療哮證，冷哮型，在臨床上治療取得了較為滿意的療效［3］，為以溫肺散寒、化痰平喘為法而組方的純中藥制劑。方中麻黃為君藥，解表散寒。麻黃、細(xì)辛、半夏諸藥相配，一散一溫一燥，增強(qiáng)了化痰之功。細(xì)辛溫肺化痰，半夏燥濕化痰，紫蘇子降氣平喘，紫菀溫肺而化痰濁，諸藥共為臣藥，使?jié)裥暗迷铩⒛鏆獾媒怠⑺畾獾蒙ⅰ㈥幒脺亍Ｗ粢灾嗣讱糠沃箍龋挚煞缆辄S過(guò)于辛散，川椒目祛痰平喘。甘草既能調(diào)和諸藥，又能化痰止咳和中，避免了君臣之藥傷及肺胃之氣，為使藥。本方正是結(jié)合冷哮的病因“外感風(fēng)寒之邪”與“內(nèi)有宿痰伏肺”進(jìn)行辨證施治立法，諸藥合用，標(biāo)本同治，共奏溫肺散寒、化痰平喘之功效。

［1］苗會(huì)，薛全福，莊逢源，等.哮喘大鼠動(dòng)物模型的制備［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，1998，18（1）：72-80.

［2］Gerthoffer WT，Singer CA.MAPK regulation of gene expression in airway smooth muscle［J］.Respir Physiol Neurobiol，2003，137（2-3）：237-250.

［3］李竹英，王晶波，王雪慧，等.止哮湯治療支氣管哮喘急性發(fā)作期臨床研究［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2012，21（8）：1207-1208.

Effect of Zhixiao Decoction on ERK1/2 Expression of Bronchial Asthma Rat Models

LI Zhu-ying1，WANG Xue-hui1，LIU Wen-bo2，et al. 1 First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heiongjiang，Harbin 150040，China；2 Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150040，China

Objective:To observe the effect and the mechanism of Zhixiao Decoction on ERK1/2 expression of bronchial asthma rats model.Methods:60 wistar rats were divided randomly into the normal control group，the model group，the dexamethasone group，the TCM low-dose group，the TCM medium-dose group and the TCM high-dose group.After the rats models establised by the OVA plus aluminium hydroxide sensitized，the histopathologic changes and the ERK1/2 content were detected and compared among these groups.Results:ERK1/2 contents in the model group were higher significantly than that in the normal control group.These expressions in the dexamethasone group and the TCM groups were lower obviously than those in the model group.This content in the TCM low-dose group was higher remarkably than that in the dexamethasone group.There were no statistical significances among the TCM medium-dose group，the TCM high-dose group and dexamethasone group.The contents in the TCM medium-dose group and high-dose group were lower obviously than those in the ow-dose group.There was no obvious significance between the TCM medium-dose group and the TCM high-dose group.Conclusion:The Zhixiao Decoction can decrease ERK1/2 in lung of asthma rats.This effect of the TCM medium-dose group and the TCM high-dose group were better than those of other gorups.

Zhixiao Decoction；Bronchial asthma；ERK1/2

R285.5

A

1004-745X（2013）06-0874-03

教育部“春暉計(jì)劃”資助項(xiàng)目（Z2009-1-15008）

△通信作者

2013-03-16）