解毒活血方對AS易損斑塊兔模型易損斑塊及CAM-1、TNF-α表達的影響*

吳 輝 卿立金△ 吳 偉 李文晞 李 榮 劉 勇 劉煜德 黃衍壽

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405）

解毒活血方對AS易損斑塊兔模型易損斑塊及CAM-1、TNF-α表達的影響*

吳 輝1卿立金1△吳 偉1李文晞1李 榮1劉 勇2劉煜德1黃衍壽1

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405）

目的 探討解毒活血中藥對易損斑塊病理及炎癥因子人細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達的影響。方法 通過球囊損傷主動脈內(nèi)膜聯(lián)合高脂飼料建立實驗性動脈粥樣硬化易損斑塊動物模型，造模兔隨機分低劑量中藥組、高劑量中藥組、辛伐他汀組、模型對照組，分別予以低劑量解毒活血方、高劑量解毒活血方、辛伐他汀、生理鹽水灌胃；另設正常對照組以生理鹽水灌胃，療程10周。觀察主動脈HE染色病理改變、斑塊ICAM-1、TNF-α免疫組化及ELISA檢測血清ICAM-1、TNF-α表達改變。結(jié)果模型對照組呈現(xiàn)易損斑塊特點，斑塊內(nèi)ICAM-1、TNF-α免疫組化正常對照組為陰性，模型對照組呈強陽性表達，高劑量中藥組表達顯著降低；低劑量中藥組呈陽性表達，辛伐他汀組TNF-α呈弱陽性表達，高劑量中藥組、辛伐他汀組血清ICAM-1、TNF-α水平降低，與模型對照組比較有明顯差異。結(jié)論 解毒活血方對實驗性兔動脈粥樣硬化易損斑塊的形成具有預防作用，能降低易損斑塊內(nèi)及血清TNF-α、ICAM-1表達，特別是抑制易損斑塊底部和肩部的炎癥。

解毒活血 易損斑塊 ICAM-1 TNF-α

△通信作者

Effect of Jieduhuoxue Decoction on Vulnerable Plaque and CAM-1、TNF-α Expression in Vulnerable

近年來研究認為動脈粥樣硬化（AS）是一種慢性炎癥性疾病［1］。炎癥反應貫穿于動脈粥樣硬化斑塊形成、發(fā)展和破裂的全過程。炎性細胞因子介導的炎癥反應在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起了極其重要的作用。前期的臨床研究表明清熱解毒、活血化瘀法治療急性冠脈綜合征有較好的療效，并能拮抗機體炎癥反應，推測抗炎可能是其主要作用機制［2］。本實驗在建立實驗性動脈粥樣硬化易損斑塊動物模型的基礎上，觀察解毒活血中藥對易損斑塊病理、斑塊內(nèi)及血清炎癥因子人細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性新西蘭白兔50只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，約2月齡，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。實驗動物許可證號：SCXK（粵）2009-0023。

1.2 試劑與儀器兔ICAM-1、TNF-α多克隆免疫組化抗體試劑盒：購自北京博奧森生物有限公司，PBS、檸檬酸抗原修復液：廣州外顯子生物公司；廣譜二抗顯色系統(tǒng)：DAKO公司；兔血清ICAM-1、TNF-α ELISA Kit RD進口分裝：購自北京索來寶科技有限公司；二甲苯；中性樹膠；顯微鏡；圖像分析軟件 Motic Images Plus 2.0光學顯微鏡400X。

1.3 藥物解毒活血方由黃連、梔子、黃柏、黃芩、川芎、赤芍、丹參、紅花、降香組成，按 1.5∶1.5∶1∶1∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶2比例由廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科煎制、濃縮成水煎劑，含5 g/mL生藥，置冰箱內(nèi)凍存，使用時以蒸餾水以1∶10比例稀釋。辛伐他汀片劑（杭州默沙東制藥有限公司，20 mg/片），使用時以蒸餾水配置成懸液給藥。

1.4 模型制備10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉動物，固定，經(jīng)耳緣靜脈注射肝素鈉200 U/kg。常規(guī)消毒皮膚、鋪巾。在無菌條件下，沿右股動脈走行方向切開皮膚，分離皮下組織及肌肉，鈍性分離右股動脈，結(jié)扎股動脈遠心端。直視下以Cordis橈動脈穿刺針穿刺股動脈，插入4F橈動脈鞘管，在PTCA導絲導引下插入2.5 mm×20 mm冠脈預擴球囊，使球囊約位于胸主動脈上段，維持壓力泵壓力6～8個大氣壓，并緩慢回拉球囊，重復操作3次，損傷胸腹主動脈內(nèi)膜。術(shù)后結(jié)扎股動脈近心端，縫合手術(shù)切口。傷口處灑8萬U慶大霉素防止感染。放回兔籠，自行蘇醒。內(nèi)膜球囊損傷術(shù)1周后開始高脂飼料，高脂飼料由普通顆粒飼料+1%膽固醇+5%豬油組成，每日120 g，自由攝水，喂養(yǎng)10周。

1.5 分組與給藥內(nèi)膜球囊損傷術(shù)后適應1周，第3周隨機分成4組，分別為低劑量中藥組、高劑量中藥組、辛伐他汀組、模型對照組，每組10只。低劑量中藥組、高劑量中藥組分別以解毒活血方40、80 g/（kg·d）灌胃；辛伐他汀組以2.6 mg/（kg·d）劑量的辛伐他汀懸液灌胃；模型對照組以生理鹽水灌胃，另設普通飼料喂養(yǎng)未行內(nèi)膜球囊損傷術(shù)正常對照組10只，以生理鹽水灌胃。各組灌胃每日1次。療程10周。

1.6 標本采集與檢測（1）HE染色觀察主動脈病理改變。給藥10周處死家兔，取胸主動脈，用10%甲醛固定，常規(guī)浸蠟、包埋、切片，HE染色，進行鏡下組織學觀察。（2）免疫組織化學染色。每組每個標本隨機取5張石蠟切片，應用免疫組化SABC法，參照試劑盒說明書操作。陽性著色為內(nèi)皮表面棕褐色反應產(chǎn)物沉積，呈胞漿染色，以PBS代替一抗作空白對照組。（3）ELISA法測定血清ICAM-1、TNF-α。給藥10周經(jīng)耳緣靜脈采取靜脈血4 mL，4℃3000 r/min離心15 min，分離血清。采用ELISA法測定血清ICAM-l、TNF-α濃度，按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明進行。

1.7 統(tǒng)計學處理應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 主動脈HE染色結(jié)果正常對照組血管組織結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜完整。模型對照組局部明顯隆起，見大量泡沫細胞，斑塊表面形成潰瘍，呈現(xiàn)易損斑塊特點。低劑量中藥組內(nèi)膜增厚，斑塊突出管腔，見中等量狀泡沫細胞。高劑量中藥組少許斑塊突出管腔，少量狀泡沫細胞，呈現(xiàn)穩(wěn)定斑塊的病理特征。辛伐他汀組有少許斑塊突出管腔，少量空泡狀泡沫細胞。見圖1。

圖1 主動脈HE染色、免疫組織化切片圖

2.2 胸主動脈免疫組織化學染色結(jié)果正常對照組偶見少量ICAM-1、TNF-α染色較淺的陽性表達細胞。模型對照組ICAM-1、TNF-α呈強陽性表達，且ICAM-1陽性表達以斑塊底部和肩部最明顯。與模型對照組比較，高劑量中藥組ICAM-1、TNF-α表達顯著降低；低劑量中藥組TNF-α呈陽性表達，但ICAM-1表達與模型對照組比較變化不明顯；辛伐他汀組TNF-α呈弱陽性表達，ICAM-1表達與模型對照組比較變化不明顯。見圖1。

2.3 血清ICAM-1、TNF-α水平ELISA檢測結(jié)果見表1。血清ICAM-1水平，與正常對照組比較，高劑量中藥組差異無統(tǒng)計學意義，余各組ICAM-1水平增高，差異有顯著性；與模型對照組比較，高劑量中藥組、辛伐他汀組ICAM-1表達水平降低，差異有顯著，而低劑量中藥組差異無統(tǒng)計學意義；高劑量中藥組與辛伐他汀組比較，差異無統(tǒng)計學意義。血清TNF-α水平，與正常對照組比較，高劑量中藥組、辛伐他汀組差異無統(tǒng)計學意義，余各組TNF-α水平增高，差異顯著；與模型對照組比較，各干預組TNF-α降低，差異顯著。

表 1 各組血清 ICAM-1、TNF-α 水平比較（±s）

表 1 各組血清 ICAM-1、TNF-α 水平比較（±s）

與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05。

組 別 n CRP（mg/L） Fbg（g/L）低劑量中藥組 8 19.123±1.742* 2.410±0.361*△高劑量中藥組 7 17.029±1.287△ 2.126±0.322△辛伐他汀組 8 17.550±0.971*△ 2.103±0.181△模型對照組 7 21.556±2.065* 3.639±0.744*正常對照組 9 14.100±2.766 1.746±0.352

3 討 論

TNF-α具有促炎癥、促凝血、抗纖溶反應作用，與動脈粥樣硬化易損斑塊密切相關(guān)，TNF-α是斑塊不穩(wěn)定的重要預測因子［3-4］。ICAM-1以血管內(nèi)皮細胞表達最強，介導細胞與細胞或細胞與基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合，與炎癥細胞的滲出定位密切相關(guān)。ICAM-1通過與炎癥因子及其他活性物質(zhì)的相互作用影響粥樣斑塊穩(wěn)定性，削弱了斑塊處的纖維帽，加快了斑塊破裂、血栓的形成，促進 ACS 發(fā)生［5-6］。

AS易損斑塊破裂導致ACS發(fā)生，起病急驟，進展迅速，變化多端，病情危重，與中醫(yī)“熱毒”病機相似。吳偉等［7-8］指出易損斑塊乃熱毒為患，其性峻烈，變化無常，常演變?yōu)楦鞣N危候，急性冠脈綜合征患者多伴有舌暗紅、苔黃膩、口干、口苦、大便秘結(jié)等表現(xiàn)，中醫(yī)病機多是熱毒血瘀。解毒活血方由黃連、梔子、黃柏、黃芩、川芎、赤芍、丹參、紅花、降香組成，有黃連解毒湯苦寒直折，清熱、瀉火、解毒之功效；川芎、赤芍、丹參、紅花、降香具有活血化瘀，通絡止痛之效。全方具有清熱解毒，活血化瘀之效。

本研究中病理學觀察提示解毒活血方對實驗性兔AS易損斑塊的形成具有預防作用，表現(xiàn)為與模型對照組相比，動脈粥樣斑塊呈現(xiàn)出穩(wěn)定型斑塊的特征，這作用呈劑量依賴性，高劑量解毒活血方的作用明顯，與辛伐他汀相當。免疫組化檢測結(jié)果顯示：中藥干預TNF-α免疫組化陽性細胞減少，顆粒染色減輕，西藥辛伐他汀治療陽性細胞的褐色顆粒染色較淺，數(shù)量減少。表明辛伐他汀、不同劑量清熱解毒活血中藥配伍進行干預治療，均具有降低兔AS模型主動脈及粥樣斑塊TNF-α表達的作用，尤其以高劑量中藥效果最明顯，與給藥濃度呈正相關(guān)。斑塊ICAM-1免疫組化模型對照組呈強陽性表達，且以斑塊底部和肩部最明顯，表明此處炎癥細胞滲出明顯；低劑量中藥組、辛伐他汀組與模型對照組比較陽性細胞表達差異不明顯；高劑量中藥組陽性細胞可見，但較模型對照組顯著減少。表明辛伐他汀、低劑量清熱解毒活血中藥配伍進行干預治療，對降低兔AS模型粥樣斑塊ICAM-1表達的作用不明顯，而高劑量中藥組能降低斑塊ICAM-1表達，抑制斑塊底部和肩部的炎癥滲出。高劑量解毒活血方、辛伐他汀都能明顯能降低血清TNF-α、ICAM-1水平，提示降低血清炎癥因子不一定能降低斑塊內(nèi)炎癥因子，穩(wěn)定易損斑塊可能主要抑制斑塊內(nèi)炎癥為主。

本實驗結(jié)果提示清熱解毒活血法能降低易損斑塊TNF-α、ICAM-l表達，特別是抑制易損斑塊底部和肩部的炎癥。這也可能是清熱解毒活血法穩(wěn)定動脈粥樣硬化易損斑的可能機制之一。

［1］Weissberg PL，Bennetl MR.Atherosclerosis：An inflammatory disease［J］.N Engl J Med，1999，340（24）：1928-1929.

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［3］Ali CA，Mustafa A，Mehmet T，et al.Levels of serum IL-1β，IL-2，IL-8 and tumor necrosis facor-α in patients with unstable angina pectoris［J］.Mediators Inflamm，2003，12（6）：361-365.

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Plaque Rabbits′Models

WU Hui，QING Li-jin，WU Wei，et al. The First Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong，Guangzhou 510405，China

Objective:To investigate the effect of Jieduhuoxue Decoction on vulnerable plaque and CAM-1 and TNF-α expression in vulnerable plaque rabbits′model.Methods:The forty vulnerable plaque models were eastablished by injuring the rabbits′abdominal-thoracic aorta intima with the balloon-injured angioplasty through femoral artery at the second week，then followed with high cholesterol feeding beginning at the third week.These forty model rabbits were randomly divided into four groups such as the model control group，the simvastatin treating group，the small-dose Jieduhuoxue Decoction group，the large-dose Jieduhuoxue Decoction group.At the third week，first of drug interventions were added during the process.And there was a normal control group those were ten healthy male New Zealand white rabbits fed with standard feed.After administered for 10 weeks，the concentrations including ICAM-1 and TNF-α in the serum were examined by ELISA.Some indices were observed and detected including the morphology of the atherosclerotic vas，the expression of ICAM-l and TNF-α in the artery with immunohistochemistry.Results:The vulnerable plaque animal model was successfully established.The aortic plaques of large-dose Jieduhuoxue Decoction group showed characteristics of stable plaque.Immunohistochemistry results found that ICAM-1 and TNF-α plaque was negative in the control group.It showed strong positive expression in model control group which was significantly decreased in the large-dose Jieduhuoxue Decoction group.This index in the small-dose Jieduhuoxue Decoction group was positive.The simvastatin group TNF-α showed weak positive expression.From the ELISA results，the TNF-α levels were reduced in the large-dose Jieduhuoxue Decoction group and the simvastatin group.Meanwhile，the serum ICAM-1 and TNF-α levels were reduced ompared with the model group.Conclusion:Jieduhuoxue Decoction could prevent atherosclerosis vulnerable plaque by lowering the expression of ICAM-1 and TNF-a in vulnerable plaque rabbits'model.The outcome was positively related to the concentrations of Jieduhuoxue Decoction.

Jieduhuoxue；Vulnerable plaque；ICAM-1；TNF-α

R285.5

A

1004-745X（2013）06-0877-03

廣東省科技計劃項目（20090315）

2013-03-03）