3種制法的四逆湯抗大鼠急性缺血性心肌梗死的藥效比較*

尹翠翠 藺建軍，2 楊 勇△ 容 蓉 王曉莉

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東醫藥技師學院，山東 泰安 271000）

3種制法的四逆湯抗大鼠急性缺血性心肌梗死的藥效比較*

尹翠翠1藺建軍1，2楊 勇1△容 蓉1王曉莉1

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東醫藥技師學院，山東 泰安 271000）

目的 比較3種制法的四逆湯抗大鼠急性缺血性心肌梗死模型的藥效，確定較佳的制劑方案。方法將Wistar大鼠隨機心肌缺血組、假手術組、傳統四逆湯組、藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組。各給藥組均預先給大鼠灌胃4 d（2 g/mL），第4日給藥30 min后進行急性缺血性心肌梗死手術，6 h后處死動物取血，檢測各組血漿CK活性、MDA和SOD含量；用TTC染色測定各組心臟梗死面積。結果 與假手術組比較，心肌缺血組血漿CK、MDA含量明顯升高；與心肌缺血組比較，傳統四逆湯組、藥典四逆湯組均能明顯降低CK含量；與假手術組比較，心肌缺血組SOD有降低趨勢，藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組有升高SOD趨勢；與心肌缺血組比較，藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組有降低MDA含量的趨勢。與假手術組比較，心肌缺血組大鼠心臟梗死率明顯增大；與心肌缺血組比較，藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組心臟梗死率均顯著縮小。結論 綜合分析后認為藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯是治療大鼠急性缺血性心肌梗死的較佳方案。

四逆湯 急性心肌梗死 制備方法 藥效學比較

△通信作者

Comparison Study of Pharmacodynamics that Three Different Extraction Methods of Sini Decoction on

四逆湯由附子、干姜、炙甘草組成，具有回陽救逆之功效，現代研究主要以此3味藥的主要有效成分含量為質控依據，篩選和優化四逆湯的最佳提取方案［1-3］。但由于中藥化學成分復雜，藥物間的配伍關系及相互作用極為關鍵，因此不能僅從有效成分含量上反映四逆湯的藥效作用強弱。為了更加真實準確地反映四逆湯對心肌的防治作用，本課題以急性缺血性心肌梗死大鼠為研究對象，通過比較3種制法的四逆湯抗大鼠急性缺血性心肌梗死模型的藥效，確定治療大鼠急性缺血性心肌梗死的較佳方案。

1 材 料

1.1 實驗動物Wistar大鼠，SPF級，雌雄各半，50只，體質量250～300 g，由山東魯抗動物實驗中心提供，動物可證編號：SCXK（魯）20080002。飼養環境：室溫22～26℃，相對濕度40%～70%RH。

1.2 實驗儀器BL-420E生物機能實驗系統，成都泰盟科技有限公司；紫外分光光度計，型號：UV2201，日本島津；半自動生化分析儀，型號：威圖Micr300，荷蘭威圖科學公司；JA5003型電子天平，上海精科天平廠；GL-20A型全自動高速冷凍離心機，湖南離心機廠。

1.3 實驗試劑肌酸激酶（CK），批號：110761；21項生化質控品，批號：111711，購自中生北控生物科技股份有限公司；丙二醛（MDA）試劑盒，批號：20111216；總超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒，批號：20110827，購自南京建成生物工程研究所；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC），批號：20110720，購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.4 實驗藥材附子，產地四川江油，為毛莨科多年生草本植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx的子根的加工品。甘草，產地河北，為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根莖。干姜，產地廣西來賓，為姜科多年生草本姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖。以上藥材經山東中醫藥大學藥學院李峰教授鑒定合格。

2 方 法

2.1 四逆湯溶液的制備

2.1.1 傳統四逆湯的制備 按照傳統臨床常用處方（黑附子450 g，干姜300 g，炙甘草450 g）用量及用法，蒸餾水浸泡1 h，加水量分別是8倍和6倍，水煎煮2次，第1次30 min，第2次20 min，合并濃縮至藥液濃度為2 g/mL（每1 mL藥液相當于2 g生藥材）。制備得四逆湯提取液，冷藏備用。

2.1.2 藥典四逆湯的制備［4］取藥材粗粉（過20目篩）黑附子450 g，炙甘草450 g，加8倍量水加熱回流提取2 h，過濾，殘渣加6倍量水加熱回流提取1 h，過濾，濾液合并。取藥材粗粉（過20目篩）干姜300 g，加12倍量水，水蒸氣蒸餾提取5 h，揮發油和蒸餾后的水溶液備用，殘渣加6倍量水煎煮1 h，過濾，煎液與上述水溶液合并，濾過，再與附子、炙甘草提取液合并，濃縮至600 mL，加無水乙醇1800 mL，靜置24 h后，濾過，減壓濃縮至適量，用適量水稀釋，冷藏24 h，濾過，加入上述揮發油，加水至600 mL，冷藏備用。

2.1.3 單藥混合四逆湯的制備［5］（1）黑附子中生物堿的提取：藥材粗粉（過20目篩）450 g，精密稱定，24倍量pH=1.0酸水提取2次，振蕩浸提，每次1.5 h，過濾，合并濾液并濃縮至約225 mL。（2）炙甘草中黃酮類的提取：藥材粗粉（過20目篩）450 g，精密稱定，加20倍量0.3%氨水-60%乙醇加熱回流提取4次，每次2 h，過濾，合并濾液并濃縮至約225 mL。（3）干姜中揮發油的提取：藥材粗粉（過20目篩）300 g，精密稱定，加14倍量水，浸泡3 h后水蒸氣蒸餾提取5 h，揮發油和蒸餾后水溶液備用，殘渣加6倍量水煎煮1 h，煎液與上次蒸餾后水溶液合并，濃縮至約150 mL。將各單味藥提取液轉移合并為600 mL，冷藏備用。

2.2 分組及造模將大鼠分為心肌缺血組、假手術組、傳統四逆湯組、藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組，每組10只。用4%水合氯醛腹腔麻醉后，氣管插管，行人工呼吸。左側第3、4肋間開胸，剪開心包，暴露心肌，并用圓形無創縫合針6/0絲線置于左冠狀動脈前降支起始部下2 mm處結扎左冠狀前降支動脈，以ECGⅡ導聯ST段明顯抬高或T波高聳、心肌顏色變暗紅色為結扎成功的標志。假手術組為穿線不結扎。傳統四逆湯組、藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組均預先大鼠灌胃4 d，給藥濃度為21.6 g/kg（即21.6 g生藥材/kg體質量），第4日給藥30 min后，進行急性缺血性心肌梗死手術，結扎大鼠左冠狀前降支動脈（方法同上）。

2.3 標本采集與檢測各組大鼠造模成功后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，6 h后分別腹主動脈采血，肝素抗凝，置冷凍離心機中，3000 r/min離心10 min，取上清，-20℃保存待用。各造模大鼠取完血后處死，迅速取出心臟，用冰生理鹽水洗盡殘血，用濾紙吸干稱重，置于-20℃冷凍15 min，15 min后將心臟橫切成1～2 mm厚薄均勻的薄片，置于pH 7.4的1%TTC磷酸鹽緩沖液中，于37℃染色15 min，4%甲醛溶液固定10 min后，分離梗死心肌和正常心肌（梗死心肌呈白色，非梗死心肌呈暗紅色），分別稱重，計算梗死心肌占全心濕重的百分比（%），即心肌梗死面積。采用半自動生化分析儀測定造模各組血漿CK活性，采用紫外分光光度計檢測血漿中SOD、MDA含量。

2.4 統計學處理應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差（LSD檢驗）進行組間差異分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 四逆湯3種不同制法對大鼠血漿中CK、SOD、MDA的影響見表1。與假手術組比較，心肌缺血組血漿 CK、MDA 含量明顯升高（P＜0.05或 0.01）；與心肌缺血組比較，傳統四逆湯組、藥典四逆湯組均能明顯降低CK含量（P＜0.01）；與假手術組比較，心肌缺血組SOD有降低趨勢，藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組有升高SOD趨勢；與心肌缺血組比較，藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組有降低MDA含量的趨勢。

表1 各組大鼠血漿中CK、SOD、MDA水平比較（±s）

表1 各組大鼠血漿中CK、SOD、MDA水平比較（±s）

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與心肌缺血組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

組 別 n MDA（nmol/mL）假手術組 10 1.61±0.77心肌缺血組 10 2.89±0.71*傳統四逆湯組 10 2.34±1.11 CK（U/L） SOD（U/mL）399.77±146.74 174.10±46.54 625.57±140.26**138.42±67.38 399.32±121.72△△ 142.39±29.83藥典四逆湯組 10 2.19±0.88 338.25±86.04△△ 155.98±36.26單藥混合四逆湯組 10 543.18±50.24 162.28±45.43 1.90±0.64

3.2 四逆湯3種不同制法對大鼠心肌梗死率的影響見表2。梗死率=梗死區面積質量/全心質量×100%。與假手術組比較，心肌缺血組大鼠心臟梗死面積明顯增大（P＜0.01），與心肌缺血組比較，藥典四逆湯組、單藥混合四逆湯組心臟梗死面積均顯著縮小（P＜0.01）。

表2 各組大鼠心肌梗死率比較（±s）

表2 各組大鼠心肌梗死率比較（±s）

組 別 n假手術組 10心肌缺血組 10傳統四逆湯組 10心肌梗死率（%）4.38±6.52 19.81±10.10**12.94±11.54藥典四逆湯組 10 4.92±3.01△△單藥混合四逆湯組 10 5.18±5.19△△

4 討 論

CK是一個與細胞內能量轉運、肌肉收縮、ATP再生有直接關系的重要激酶，是心肌梗死的重要血生化指標。在各類進行性肌營養不良以及多發性肌炎、皮肌炎中CK明顯升高，并具有診斷價值。在臨床上，CK及其同工酶活性的檢測主要用于診斷與監控心肌損傷等疾病。本實驗結果顯示，與心肌缺血組組比較，3種制法的四逆湯均可降低心肌缺血大鼠血漿中CK含量，其中傳統四逆湯組和藥典四逆湯組具有顯著差異，單藥混合四逆湯組雖有降低趨勢，但是并無明差異，提示傳統四逆湯組和藥典四逆湯組在降低CK活性上效果均優于單藥混合四逆湯組。SOD具有特殊的生理活性，在生物體內具有清除自由基的首要作用，研究表明SOD對氧化物和過氧化物的毒性防御具有重要作用，通過消除自由基達到保護細胞的作用。MDA是機體通過酶系統與非酶系統能產生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸產生脂質過氧化作用形成的脂質過氧化物，通過測定MDA的含量揭示了自由基引發的脂質過氧化在腦缺血、心缺血、缺氧神經細胞損害中的作用。本實驗結果顯示與心肌缺血組比較，3種制法的四逆湯均可提高SOD含量，同時降低MDA含量，其中單藥混合四逆湯組作用效果最為明顯。因大鼠體質量及心臟大小有差異，故用梗死率比較梗死程度。在各實驗組心肌梗死率比較中，與心肌缺血組比較，3種不同制法的四逆湯均可縮小大鼠急性缺血性心肌梗死率，其中藥典四逆湯組和單藥混合四逆湯組差異顯著，其結果與假手術組差異較小，提示藥典四逆湯和單藥混合四逆湯組的制備方法均優于傳統四逆湯的制備方法。

本實驗通過多指標對3種不同制法的四逆湯抗大鼠急性缺血性心肌梗死的藥理作用進行了評價，認為四逆湯能夠有效清除氧自由基，減少自由基損壞性因子，減輕脂質過氧化反應，減少心肌酶釋放，改善缺血心肌灌流，對大鼠心臟具有積極保護作用，其藥效作用的強弱與四逆湯的制備方法密切相關。本實驗結果提示傳統四逆湯在降低急性心肌缺血大鼠血漿中CK活性上效果較好，但是對血漿中SOD、MDA及心肌梗死率影響較小，因此不認為此治療方法是抗大鼠急性缺血性心肌梗死的較佳方案。藥典四逆湯降低急性心肌缺血大鼠血漿中CK活性的效力強于單藥混合四逆湯，但是在提高SOD、降低MDA的含量效果上弱于單藥混合四逆湯，兩者在縮小急性心肌缺血大鼠心肌梗死率上效果相近，與急性心肌缺血組比較均具有顯著差異，綜合分析后認為藥典四逆湯、單藥混合四逆湯是治療大鼠急性缺血性心肌梗死的較佳方案。

［1］李瑩，章津銘，傅超美，等.不同方法制備四逆湯中化學成分對比研究［J］.中草藥，2012，34（4）：673-677.

［2］凌家俊，周莉玲.四逆湯提取工藝的篩選［J］.廣州中醫藥大學學報，2000，17（4）：167-169.

［3］劉曉，范林乾，蔡皓，等.正交試驗優選四逆湯機械煎煮工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（20）：24-27.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：650.

［5］王曉莉，鞏麗麗，容蓉，等.3種方法制備的四逆湯中甘草苷、甘草酸含量測定［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（6）：71-74.

Anti-acute Ischemic Myocardial Infarction

YIN Cui-cui1，LIN Jian-jun1，2，YANG Yong1，et al. 1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Shandong，Jinan 250355，China；2 Shandong Medicine Technician College，Shandong，Jinan 271000，China

Objective:To compared the pharmacodynamics that Sini Decoction with three methods of extraction o anti-acute ischemic myocardial infarction and to determine a better solution for the treatment of anti-acute ischemic myocardial infarction.Methods:Wistar rats were divided randomly into the myocardial ischemia group，he sham-operation control group，the traditional Sini Decoction（SND） group，the pharmacopoeias SND group and THE single-agent mixed SND group.The myocardial ischemia rat group were established by ligation of the left anterior descending coronary artery under 2 mm from starting.The sham-operation group rats were threaded but not ligation.The traditional SND group，the pharmacopoeias SND group，and the single-agent mixed SND group ats were all given SND for 4 days by intragastric administration.The acute ischemic myocardial infarction operaion was executed after

SND thirty minutes in the fourth day.These animals were sacrificed after 6 hours and the blood was collected.Then detected the CK activity，the contents of MDA and SOD in blood plasma of every group.TTC stained myocardial infarct size was measured.Results:Comparing with the sham-operation group，he contents of CK，MDA in myocardial ischemia group were significantly increased.Compared with the myocardial ischemia group，the traditional SND group，pharmacopoeias SND group could reduce the contents of CK obviously.Comparing with the sham-operation group，the contents of SOD in myocardial ischemia group had the trend o decrease，and pharmacopoeias SND group，and single-agent mixed SND group had the trend to increase.Compared with the myocardial ischemia group，the contents of MDA in pharmacopoeias SND group，and single-agent mixed SND group had the trend to decrease.Comparing with sham-operation group，myocardial infarct size of the myocardial ischemia group was enlarged remarkably.Compared with the myocardial ischemia group，myocardial nfarct sizes of pharmacopoeias SND group and single-agent mixed SND group were significantly reduced.Conclusion:It is showed that SND can remove effectively oxygen free radicals.It can reduce the free radical damage actor，the lipid peroxidation and the release of myocardial enzymes.Meanwhile，It can improve the perfusion of myocardial ischemia and protect positively to myocardial ischemia of the rat.It is considered that pharmacopoeias SND and single-agent mixed SND are the better solutions for the treatment of acute ischemic myocardial infarction by comprehensive analysis.

Sini Decoction；Acute myocardial infarction；Extraction methods；Pharmacodynamics comparison

R285.5

A

1004-745X（2013）06-0880-03

山東省高等學校科技計劃項目（J10LF20）

2013-03-04）