針刺水溝、風(fēng)府穴對(duì)急性大鼠脊髓損傷后前炎性因子表達(dá)的影響*

鄒恩苗 王 賽 李江筎 蔣松鶴

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027）

針刺水溝、風(fēng)府穴對(duì)急性大鼠脊髓損傷后前炎性因子表達(dá)的影響*

鄒恩苗 王 賽 李江筎 蔣松鶴△

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027）

目的 觀察針刺水溝，風(fēng)府穴對(duì)大鼠急性脊髓損傷（SCI）后前炎性因子表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法 雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刺組，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)前炎性因子包括白介素-6（IL-6），白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α） mRNA 的表達(dá)情況；用原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)SCI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，用HE及Nissle染色觀察組織細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果 SCI后8 h，模型組與假手術(shù)組比較受損傷的脊髓組織中模型組中前炎性因子mRNA表達(dá)水平顯著升高，且TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)增多，針刺組大鼠受損傷的脊髓組織中前炎性因子mRNA表達(dá)水平與TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較模型組均減少。結(jié)論 針刺水溝風(fēng)府穴可降低大鼠急性SCI后脊髓組織中前炎性因子的表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

脊髓損傷 針刺 前炎性因子 凋亡

△通信作者

Effects of Acupuncture at Shuigou （GV26） and Fengfu （GV16） on the Expression of Pro-inflammation

脊髓損傷（SCI）及其再生機(jī)制是當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)的研究熱點(diǎn)，如何減輕SCI及其后的各種繼發(fā)性損傷，促進(jìn)被損傷神經(jīng)纖維再生和上下行神經(jīng)通路重建，備受相關(guān)學(xué)者關(guān)注，尤其是繼發(fā)性損傷，更是研究的重點(diǎn)［1］。繼發(fā)性損傷在脊髓損傷后數(shù)分鐘就開始，可以持續(xù)數(shù)天，進(jìn)一步導(dǎo)致脊髓的損傷和功能的缺失。近年來研究表明急性SCI后炎癥相關(guān)基因表達(dá)增加，特別是在脊髓損傷后3～72 h［2-3］。針刺作為一種非藥物療法，具有疏經(jīng)活絡(luò)，調(diào)節(jié)臟腑氣血平衡，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)再生的功效，而脊髓損傷后早期給予針刺

治療具有促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用［4～5］。本研究建立大鼠脊髓急性損傷模型，經(jīng)針刺水溝風(fēng)府穴治療后觀察脊髓組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡及前炎性因子IL-6，IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SD雄性大鼠36只，清潔級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，購自溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（浙）2010-0150，分籠飼養(yǎng)。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25℃，濕度42%～50%。隨機(jī)將大鼠分為假手術(shù)組、模型組和針刺組，每組12只。

1.2 模型制備SD大鼠經(jīng)5%水合氯醛腹腔注射麻醉。將動(dòng)物俯臥固定于自制大鼠手術(shù)臺(tái)上，背部剃毛，常規(guī)消毒，以T10為中心，沿背部正中切開，切口長(zhǎng)約2～3 cm，咬除T9～11棘突及全部椎板，暴露T10脊髓，使硬脊膜完整，通過 NYU Impactor［6］精確撞擊，制作大鼠SCI（T10）中度損傷模型（10 g，25 mm）。 模型成功標(biāo)志：脊髓打擊部位瘀血，大鼠尾巴痙攣性擺動(dòng)，雙下肢軀體回縮樣撲動(dòng)，雙下肢馳緩性癱瘓。損傷后逐層縫合切口，并消毒表面。術(shù)后獨(dú)籠飼養(yǎng)，仔細(xì)護(hù)理。

1.3 干預(yù)方法實(shí)驗(yàn)大鼠固定于自制柔性大鼠固定器［7］。假手術(shù)組與模型組大鼠不做其他干預(yù)。針刺組于大鼠水溝、風(fēng)府各刺入一毫針，針刺深度為1 mm，于脊髓損傷后30 min治療及損傷后4 h后再治療1次，治療 30 min/次。

1.4 標(biāo)本采集于大鼠損傷8 h后取材。動(dòng)物麻醉后，經(jīng)心臟升動(dòng)脈先灌注37℃生理鹽水300 mL沖洗組織內(nèi)血液，繼之灌注4℃4%多聚甲醛（pH7.4）200 mL固定組織，1 h后以損傷中心取脊髓，置4%多聚甲醛中4℃中過夜。然后梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片。脊髓切片厚度4μm。以損傷區(qū)為中心取5mm脊髓置于無RNA酶的凍存管中放入液氮內(nèi)速凍后轉(zhuǎn)至-80℃超低溫冰箱保存。

1.5 TUNEL原位末端標(biāo)記法參照Roche公司Insitu cell Death Detection，POD試劑盒說明書進(jìn)行操作，將脊髓組織切片常規(guī)脫蠟，脫水，20 μg/mL蛋白酶K 20 min，TUNEL反應(yīng)復(fù)合物37℃水浴箱閉1 h后在熒光鏡下觀察，Convert-POD 37℃水浴箱閉光30 min，各步間均用PBS充分洗滌，DAB顯色，蘇木素復(fù)染后，光鏡下觀察及計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。陰性對(duì)照：TUNEL反應(yīng)復(fù)合物中不加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，其他同上，鏡下觀察有無 TUNEL標(biāo)記細(xì)胞。

1.6 HE及Nissle染色參照HE及Nissle試劑盒說明書進(jìn)行操作，將脊髓組織切片常規(guī)脫蠟，脫水，染色，鏡下觀察組織細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑盒：TRIzol Reagent（invitrogen15596-026）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Fermentas K1622）、熒光實(shí)時(shí)定量試劑盒 SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa Code：DRR420A）。IL-6引物序列如下：上游引物5'-AAGTTTCTCTCCGC AAGATACTTCCAGCCA-3'，下游引物 5'-AGGCAAAT TTCCTGGTTATATCCAGTTT-3'；IL-1β 引物序列如下：上游引物5'-GCAGCTACCTATGTCTTGCCCGTG-3'，下游引物 5'-GTCGTTGCTTGTCTCTCCTTGTA-3'；TNF-α引物序列如下：上游引物5'-CCCAGACCCTCACACTC AGAT-3'，下游引物5'-TTGTCCCTTGAAGAGAACCT G-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。依據(jù)說明書，用TRIzol試劑提取脊髓組織總RNA，取1μg RNA以O(shè)ligo（dT）為引物反轉(zhuǎn)cDNA備用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體步驟參考ROCHE公司的SYBR Premix Ex TaqTM試劑說明書，GAPDH為內(nèi)參照基因。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，溶解曲線分析確保反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。不同組目的基因的表達(dá)差異基于其Ct值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（±s）表示。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 針刺對(duì)脊髓組織形態(tài)學(xué)的影響（1）HE染色。假手術(shù)組可見脊髓結(jié)構(gòu)完整，灰白質(zhì)邊界清楚，可內(nèi)見正常形態(tài)的神經(jīng)元，核仁較大且居中（見圖A1）。針刺組可見脊髓結(jié)構(gòu)欠清晰，灰白質(zhì)分界不清，出血壞死模型組輕，神經(jīng)元?dú)埩簦旧：Y(jié)構(gòu)不清（見圖A2）。模型組可見脊髓結(jié)構(gòu)破壞，中央?yún)^(qū)碎裂，灰質(zhì)及白質(zhì)廣泛出血，灰質(zhì)中可見缺損區(qū)，大量神經(jīng)元核固縮，胞漿紅染加深并有凋亡小體形成（見圖A3）。（2）Nissle染色。假手術(shù)組脊髓尼氏染色見結(jié)構(gòu)完整、清晰，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目多（見圖B1）。針刺組介于上述二者之間，形態(tài)尚保留，胞質(zhì)內(nèi)染色減輕，呈顆粒狀，神經(jīng)元保留，但數(shù)目減少（見圖B2）。模型組神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，數(shù)目明顯減少。尼氏體的急劇減少（見圖B3）。

圖A 脊髓HE染色觀察（×400）

圖B 脊髓Nissle染色觀察（×400）

2.2 針刺對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響在術(shù)后8 h，假手術(shù)組可見少量陽性細(xì)胞（見圖C1）。針刺組可見陽性細(xì)胞數(shù)比模型組明顯減少（見圖C2）。模型組可見大量陽性細(xì)胞表達(dá)，白質(zhì)及灰質(zhì)中均可見（見圖C3）。提示針刺能明顯抑制脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。損傷8 h后模型組大鼠受損傷的脊髓組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)較假手術(shù)組增高（P＜0.05），針刺組受損傷脊髓組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組降低（P＜0.05）（見表 1）。

圖C 脊髓TUNEL DAB染色觀察（×200）

表1 各組細(xì)胞凋亡指數(shù)（%）

2.3 針刺對(duì)脊髓后 IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量顯示（見表2），損傷8 h后模型組大鼠受損傷的脊髓組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加 （P＜0.01），針刺組受損傷脊髓組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)較模型組減少（P＜0.05）。

表 2 各組 TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（±s）

表 2 各組 TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（±s）

組 別 n TNF-α IL-1βIL-6假手術(shù)組 8 0.60±0.36△△ 0.77±0.40△△模型組 8 4.18±2.04 5.81±3.02 0.05±0.02△△6.05±2.83針刺組 8 2.31±0.75△ 3.87±2.66△3.70±2.17△

3 討 論

脊髓損傷后，繼發(fā)性損害是導(dǎo)致脊髓損傷難以恢復(fù)的關(guān)鍵因素之一，而繼發(fā)性損害具有可逆性、可控性，是可以人為介入干預(yù)的，因此，通過各種治療手段維持脊髓微循環(huán)穩(wěn)定，抑制脊髓毒害因素，延緩或抑制存活的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)一步損傷是近年來研究重點(diǎn)［8］。近年研究認(rèn)為針刺能減輕脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷，減輕和延緩急性脊髓損傷早期病理損害，改善脊髓微循環(huán)，以達(dá)到保護(hù)脊髓組織；促進(jìn)受損脊髓合成和分泌內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)脊髓下行纖維再生和脊髓功能恢復(fù)［9-10］。針刺選穴配穴方面［11］，水溝、風(fēng)府穴均屬督脈經(jīng)穴，前者分布有敏感而易于傳導(dǎo)強(qiáng)烈刺激的神經(jīng)末梢，是休克狀態(tài)下針灸急救的名穴；后者穴下深層為延髓區(qū)域，是臨床治療外傷性截癱和脊髓型頸椎病的常用穴位。兩穴相配，具有通泄督脈、開竅救急之功，可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后超早期的炎性水腫反應(yīng)有抑制作用［12］。已有研究表明水溝-風(fēng)府針刺可以激活雙側(cè)大腦與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的功能區(qū)，誘導(dǎo)與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的神經(jīng)組織興奮，補(bǔ)償或協(xié)助受損的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重建［13］，但對(duì)脊髓損傷治療研究甚少。

有研究表明脊髓受外傷打擊時(shí)，白質(zhì)的損傷更多的是由于繼發(fā)損傷所導(dǎo)致，神經(jīng)元和神經(jīng)腔質(zhì)細(xì)胞死亡亦不是緣于直接損傷，而是繼發(fā)細(xì)胞凋亡的結(jié)果［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺水溝、風(fēng)府后對(duì)大鼠脊髓損傷后的一些病理改變有顯著改善，可減輕損傷部位片狀出血及囊腔，組織疏松水腫，神經(jīng)細(xì)胞腫脹等有所改變。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在形態(tài)學(xué)提示針刺水溝、風(fēng)府對(duì)損傷段脊髓的有一定的保護(hù)作用。

近年來的研究表明SCI后促發(fā)的局部炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致SCI的重要機(jī)制［15-16］，其主要涉及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和血管通透性改變、水腫、白細(xì)胞浸潤、血腦屏障破壞、炎性介質(zhì)釋放、轉(zhuǎn)錄因子及補(bǔ)體激活、急性期反應(yīng)蛋白表達(dá)、粘附分子表達(dá)等病理過程。SCI的炎性反應(yīng)主要包括兩種成分：炎性細(xì)胞和以細(xì)胞因子為代表的炎性介質(zhì)。其中，以TNF-α、IL-1β、IL-6為代表的前炎性細(xì)胞因子不僅作為效應(yīng)分子在SCI后炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［17］，而且常常作為炎癥反應(yīng)的信號(hào)分子，它們?cè)趽p傷組織的表達(dá)水平往往可反映炎癥反應(yīng)的程度。抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等的過度表達(dá)以減輕炎癥反應(yīng)程度，發(fā)揮對(duì)SCI的治療作用，已成了研究的重點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，SCI后8 h模型組與假手術(shù)組比較，IL-6，IL-1β，TNF-α mRNA 表達(dá)明顯增加，針刺水溝風(fēng)府后電針治療組受損傷脊髓組織中IL-6，IL-1β，TNF-α mRNA表達(dá)較模型組減少，因此推測(cè)，大鼠急性SCI后，針刺水溝、風(fēng)府穴治療可能是通過抑制受損傷脊髓組織表達(dá)致炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α，從而減輕脊髓損傷后炎癥，促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。

有研究表明，脊髓損傷后前炎性因子表達(dá)的增高，與誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)［18］。大鼠脊髓損傷4 h后，在損傷區(qū)內(nèi)神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，8 h達(dá)到高峰。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞在傷后4 h出現(xiàn)，24 h達(dá)到高峰［19］。本研究結(jié)果顯示，SCI后8 h模型組與假手術(shù)組比較，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)增多，針刺水溝風(fēng)府后受損傷脊髓組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較模型組減少，因此推測(cè)，大鼠急性SCI后，針刺水溝、風(fēng)府穴治療可能是通過抑制受損傷脊髓組織表達(dá)致炎因子IL-6，IL-1β，TNF-α，從而減輕脊髓損傷后細(xì)胞凋亡，促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。

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Cytokine after Spinal Cord Injury

ZOU En-miao，WANG Sai，LI Jiang-ru，et al. The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Zhejiang,Wenzhou 325027,China

Objective：To investigate the effect of acupuncture at Shuigou （GV26） and Fengfu （GV16） on neuronal apoptosis and the expression of pro-inflammation cytokine after spinal cord injury in rats.Methods：36 SD rats were divided into 3 groups:sham-operated group,model group,acupuncture group.The expression of TNF-a,IL-1β and IL-6 mRNA were detected by quantitative Real Time-PCR （qRT-PCR）.Apoptosis neuron was marked with terminal deoxynucleotidyl transferase-midiated deoxyuredine triphosphate-biotin nick end labeling（TUNEL） staining.Organizational changes in cell morphology were observed by HE and Nissle dyeing.Results：Comparing with sham-operated group,the expression of mRNA in model group was markedly increased in the injured spinal cord at 8h after injury,and there were more TUNEL-positive cells in model group than in shamoperated group.Compared with control group,acupuncture significantly reduced the expression of TNF-α,IL-1β and IL-6 mRNA,and decreased the number of TUNEL-positive cells.Conclusion:Acupuncture may inhibit the expression of expression of pro-inflammation cytokine and reduce neuronal cell apoptosis after SCI.

Spinal cord injury；Acupuncture；Pro-inflammation cytokine；Apoptosis

R245

A

1004-745X（2013）06-0883-04

浙江省自然科學(xué)基金課題（LY12H27002）；浙江省溫州市科技局基金項(xiàng)目（Y20110069）

2013-02-18）