復合酶提高黃柏水提效率的關鍵技術研究*

文洪宇 陳 曦 黃 彥 陳 玲 宋 健 楊雅淋 王 琴 張洪雷△

（1.重慶市中醫研究院，重慶 400021；2.成都九芝堂金鼎藥業有限公司，四川 成都 610101）

復合酶提高黃柏水提效率的關鍵技術研究*

文洪宇1陳 曦2黃 彥1陳 玲1宋 健1楊雅淋1王 琴1張洪雷1△

（1.重慶市中醫研究院，重慶 400021；2.成都九芝堂金鼎藥業有限公司，四川 成都 610101）

目的 探討提高黃柏水提工藝效率的方法。方法 在黃柏水提工藝程序中，加入纖維素酶-果膠酶-半纖維素酶組成的復合酶，按均勻試驗設計考察5因素10水平 ，用SAS8.2統計分析，測定過濾速度及水提液的浸出物變化作指標，考察酶解工藝條件。結果 每克黃柏取相當于酶活力1萬U的纖維素酶，0.5萬U的果膠酶，0.1萬U的半纖維素酶，調溫度37℃，pH為3.9的酶解條件下得到的黃柏水提液，分離速度提高5.64倍，黃柏堿與小檗堿收率分別提高2.17、1.14倍。結論 應用復合酶可提高黃柏水提工藝的生產效率。

復合酶 黃柏 水提工藝 分離提速

△通信作者

Research on Key Technology of Improvment on the Efficiency of Cortex Phellodendri Chinensis Water -fd

黃柏主要有效成分為季銨型生物堿，如小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、掌葉防己堿、藥根堿等［1］，均為水溶性生物堿，故目前提取黃柏生物堿的方法多采用水浸提法，主要是酸水法、石灰乳法、超聲波提取等［2-3］。但由于黃柏皮性質堅韌，水溶劑不易穿透進入纖維素內部，細胞壁內有效成分溶出率不高，再有黃柏含大量黏液，黏液通常為具有分支結構的雜多糖，含黏液質的黃柏提取物制成的中藥丸、片等，崩解時限不易合格，實際生產效率低。復合酶法有助于保持天然產物構象及成分原有性質，操作簡便易行，保留原設備生產線，故本實驗對復合酶改進黃柏水提工藝進行研究。

1 材 料

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮，藥材來自重慶南川，由重慶桐君閣股份有限公司曾憲策主任中藥師鑒定。實驗用酶果膠酶活力210萬U/g，半纖維素酶活力40萬U/g，纖維素酶活力40.1萬U/g，均由寧夏夏盛實業集團生產提供。

2 方 法

2.1 工藝路線選擇據黃柏藥材理化性質，結合酶特性［4］，檢索文獻資料，經預試篩選，確定提取工藝路線如圖1。

圖1 黃柏水提工藝路線

2.2 工藝條件研究本實驗提取生物堿的方法包括酶促浸提和滅酶濃縮兩個階段。第1階段主要作用是酶解細胞表面纖維、半纖維木質結構及黏液物，熱水浸提利于生物堿的分離、溶出；第2階段通過加熱，既具有滅酶活的作用，同時又濃縮藥材至規定量。

2.2.1 考察指標的選擇 （1）浸出物含量測定：精密量取供試品續濾液10 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，在水浴上蒸干后于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量。以干燥品量計算供試品中浸出物含量作收率考察指標。（2）單位時間濾液量測定：藥液以500 mL漏斗0.2 MPa真空抽濾，φ11 cm雙層快速濾紙濾過，量取酶提取分離程序中20 min內通過的濾液總量，計算單位時間濾液量（mL/min）作為分離速度考察指標。

2.2.2 復合酶提取分離試驗 根據酶特性，選擇纖維素酶-果膠酶-半纖維素酶組合成復合酶［5］，加入到難濾皮類藥材黃柏的水提工藝中，測定過濾速度及水提液的浸出物變化作指標，考察酶解工藝條件。酶解條件由于涉及因素水平多，根據文獻報道、各相關酶使用要求及預試情況，按均勻試驗設計考察5因素10水平，因素水平表見表1。實驗以0.5%稀硫酸、5%Ca（OH）2水溶液調節pH值。黃柏粗粉加15倍水，加熱溫度、調節pH值到所需條件時，將酶按1∶10加適當溫度的水稀釋，緩緩加入到物料中攪拌均勻，恒溫酶解，過濾。

表1 因素水平表

根據 U 11（11 10）的使用表選擇 5 因素：1、2、3、5、7列。固定其他條件，改變5因素的水平，按均勻設計條件進行試驗，并做重復試驗2次，各實驗批次的提取液，按考察指標“單位時間濾液量測定”項下含量測定方法測定，計算單位時間濾液量；按“浸出物含量測定”項下方法測定，計算浸出物收率。試驗設計及結果見表2。

將5因素10水平數據規格化后進行計算，試驗計算中由于各因素的復雜相關性，均勻試驗軟件不能單獨處理，用SAS 8.2運算擬合，其中綜合評分考慮指標重要程度及數量級差，權重系數分配為 單位時間濾液量與浸出物收率為1∶1。結果回歸方程如下：Y=18.69+467.63C-416.92C2-72.34E2+123.71AD-56.38BC-24.64BE-58.45CD（R2=0.9995），根據相關系數，C 為最大影響因素。結合實際生產條件，y預測值在y最大預測值95%范圍內，選較優規格化數據：A=1，B=0，C=0.49，D=0.89，E=0，y 預測值=232.33。

表2 試驗設計及結果表

確定酶解條件為：酶解溫度37℃，酶解時間180min，酸堿度為3.9，每克黃柏使用復合酶：1萬U纖維素酶，0.5萬U果膠酶，0.1萬U半纖維素酶。

2.2.3 工藝條件驗證 根據確定酶解條件，重復酶解程序操作，測定分離速度及黃柏堿、小檗堿含量；與未加酶常規熱水提取操作比較，計算黃柏堿、小檗堿收得率和分離速度提高倍數。分離速度測定同2.2.1項下單位時間濾液量測定法操作。黃柏堿、小檗堿含量照2010版《中國藥典》一部（附錄Ⅳ D）高效液相色譜法一次進樣測定。

色譜條件：色譜柱 C18（250 mm×4.6 mm，110 A），流動相為乙腈（A）-0.025mol/L磷酸二氫鈉（含0.0125mol/L的十二烷基硫酸鈉）（B），梯度洗脫，梯度洗脫程序為0～15 min，35%A-65%B；15～35 min，50%A-50%B，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，檢測波長265 nm。分別精密稱取鹽酸黃柏堿、鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇溶解，制成混合對照品溶液（每毫升含鹽酸黃柏堿0.13mg、鹽酸小檗堿1.26 mg）。精密量取樣品液0.4 mL，水浴蒸干，殘渣以甲醇溶解稀釋至于10 mL，制成供試品溶液。分別精密吸取上述對照品與供試品溶液5～20 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。工藝條件驗證測定結果見表3。測定結果表明工藝可行。

2.3 制備工藝按處方量數倍稱取檢驗合格的黃柏原生藥飲片，粉碎成粗粉，備用；稱取處方量黃柏，加15倍水浸潤，調溫度37℃，pH為3.9；另每克黃柏取相當于酶活力1萬U的纖維素酶，0.5萬U的果膠酶，0.1萬U的半纖維素酶，加水10倍調勻，緩緩加入黃柏水浸液中，攪勻，保溫180 min，200目篩過濾，濾液備用；黃柏藥渣繼續加10倍水，常規煎煮1 h，200目篩過濾，濾液合并，滅酶，濃縮至規定量（相當于生藥1 g/mL）即得。

表3 工藝條件驗證測定結果

3 討 論

復合酶改進黃柏水提工藝與傳統提取法相比，提取液澄清度和有效成分收率提高，提取溫度接近人體溫度，速度快，藥材利用率高，降低了生產成本，不需增加生產線新設備投入，宜于大規模生產。

初步工藝路線在藥材中直接加入酶液 （1∶10）拌勻，認為可減少酶用量，但實際操作中酶液加入到干物料中不易攪拌均勻，且整個程序待時較長。酶的專一性、特異性等特點，決定其酶用量與底物量相關，實際工藝中加入大量水浸潤，藥材與酶充分接觸，提取過程中無需再攪拌。

［1］南京中醫藥大學.中藥大辭典 （下冊）［M］.2版.上海：上海科技出版社，2006：2822.

［2］尹蓉莉，楊軍宣，李化，等.黃柏中鹽酸小檗堿提取實驗方法的改進［J］.基層中藥雜志，2000，14（6）：27-29.

［3］國家藥品監督管理局信息中心文獻資料.超聲提取黃柏中小檗堿成分的研究，中藥制藥技術與工藝匯編［M］.北京：化學工業出版社，2002：1.

［4］文洪宇，李洪，段硯.應用于中藥提取分離中的酶的綜述［J］.中國醫藥指南，2009，7（10）：203-205.

［5］文洪宇，李洪，楊娟，等.酶解技術在中藥提取分離中的應用進展［J］.湖南中醫藥大學學報，2007，8（27）：352-354.

extraction by Composite Enzyme

WEN Hong-yu1，CHEN Xi2，HUANG Yan1，et al.1 Chongqing Academy o Traditional Chinese Medicine，Chongqing 400021，China；2 Chengdu Jiuzhitang-jinding Pharmaceutical Limite Company，Sichuan，Chengdu 610101，China

Objective:To study and improve the efficiency of the Cortex Phellodendri Chinensis water-extracting process.Methods:The process of Cortex Phellodendri Chinensis water-extraction was added in composite enzyme which comprises of“cellulose enzyme”-“pectinase”-“half of cellulose enzyme”，with the basis on the uniform experimental design investigating the 5 factors and 10 levels，with the SAS 8.2 statistical analysis.The filtration speed and water extraction fluid extract change index was examined enzyme solution process conditions.Results:Each 1g cortex phellodendri taking the enzyme activity was equivalent to 10000 U the cellulose enzyme，5000 U pectinase，1000 U half cellulose enzyme.The temperature was 37 ℃，pH 3.9 of enzyme solution obtained under such condition.The separating speed was increased by 5.64 times，cortex phellodendri alkali and berberine were ncreased yield 2.17，1.14 times.Conclusion:Application of composite enzyme can improve the Cortex Phelodendri Chinensis water-extracting process production efficiency.

Complex enzyme；Cortex Phellodendri Chinensis；Water-extracting technology； Separation speed

R285

A

1004-745X（2013）06-0898-03

重慶市中醫藥科技計劃項目（2006-B-07）

2013-03-06）