ATP－生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性檢測方法的應用探討

王鈺瑩 羅 清 胡 康 劉 頌 張霓霓 余麗梅*

1.遵義醫學院附屬醫院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州 遵義 563003;2.遵義醫學院附屬醫院腫瘤醫院，貴州 遵義 563003;3.遵義醫學院附屬醫院甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563003;4.遵義醫學院附屬醫院婦科，貴州 遵義 563003;5.遵義醫學院附屬口腔醫院，貴州 遵義 563003

化學治療是治療惡性腫瘤的三大治療手段之一，由于腫瘤患者存在個體差異及腫瘤的異質性，腫瘤對各種化療藥物存在著明顯的個體差異［1，2］，特別是腫瘤復發和經過多次化療的患者。因化療前缺乏患者對化療藥物敏感性和耐藥性的直接檢測證據，在制定化療方案時不可避免地存在著一定的盲目性，選擇藥物不準確。多數化療藥物本身的不良反應可造成對機體的損害，更重要的是可誘導腫瘤細胞產生多藥耐藥性，貽誤治療時機，增加醫療成本和患者的經濟負擔。因而在治療前篩選敏感藥物，選擇高效、有效藥物，進行有的放矢的治療早已成為研究者和臨床醫生關注的重要問題。

體外抗腫瘤藥物敏感試驗的方法及結果準確與否是影響病人治療方案制訂的關鍵因素。本室對121例開展了ATP－生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性的檢測，現將檢測情況總結如下。

1 材料與方法

1.1 腫瘤標本 收集2011年9月至2012年12月我院121例腫瘤患者的標本進行ATP－生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性檢測。其中乳腺癌89例，卵巢癌16例，子宮內膜癌4例，宮頸癌4例，口底鱗癌4例，肺癌3例，非霍奇金淋巴瘤1例。121例患者，年齡在29～76歲。

1.2 化療藥物化療藥物為100%藥物血漿峰值濃度(100%PPC)(見表1)。聯合用藥的每個藥物的濃度與單藥濃度相同。

表1 化療藥物及劑量

*因CTX和IFO在體外無活性，實驗中所采用的是CTX的體內活化物苯丁酸氮芥CLB替代。

1.3 儀器和試劑 BHP9504型微孔板發光分析儀(北京濱松光子技術股份有限公司)。ATP生物熒光腫瘤藥物敏感性檢測試劑盒，含混合消化酶、培養基、紅細胞裂解液、細胞培養板(96孔)、ATP提取液和熒光酶－熒光素工作液(北京金紫晶生物醫藥技術有限公司)。

1.4 體外藥敏檢測實驗

1.4.1 實體瘤標本制備 無菌取得實體瘤手術標本，在含抗生素的培養基中浸泡25min后，剪成0.5～1mm3碎塊，置于50 ml離心管中，加用培養基稀釋1倍的混合消化酶10ml，于37℃消化2～4h，用培養基洗滌2次，獲得單細胞懸液。臺盼藍染色，計數活的腫瘤細胞。

1.4.2 漿膜腔積液標本的制備 將肝素抗凝的漿膜腔積液標本，400g離心10min，去上清，如有大量紅細胞(＞25%)，加入預冷的10ml紅細胞裂解液，冰浴5～10min紅細胞去除紅細胞，再加入20ml RPMI 1640培養液，400g離心10分鐘，去上清，加入3～5ml培養基混勻制備得細胞懸液。臺盼藍染色，計數活的腫瘤細胞，調整細胞密度于2～4×106個/ml備用。

1.4.3 加待測藥物于96孔培養板，每個藥物設100%、50%、25%、12.5%和6.25%PPC 5個濃度，每個濃度2個平行孔，并設無藥對照組(M0)，和最大抑制對照組(MI)。接種所得腫瘤細胞，細胞數為2×104個/孔。在37℃，5%CO2條件下培養5d后，開始測定。最大抑制對照孔加50μl最大抑制劑，其余各孔加50μlATP提取液，在震蕩器上震蕩30s，室溫靜置5min。再次震蕩混勻。每孔取50μl液體，按相應的位置加到熒光測試板內，每孔加入50μl熒光素－熒光酶混合液。再次震蕩混勻5s，立刻在微孔板發光分析儀上測定熒光強度。

1.5 藥敏檢測判定標準 計算藥物IC90和IC50。IC90＜90%且IC50＜25%判定為高度敏感;IC90＜90%或IC50＜25%判定為中度敏感;IC90＞90%且IC50＞25%判定為不敏感。

1.6 吉姆薩染色檢測漿膜腔積液中脫落細胞 收集的漿膜腔積液標本離心后制備的細胞懸液，取0.4ml，按常規方法進行制片及染色。

2 結果

2.1 標本的可評價率 收集的121例標本中，原發灶手術標本61例，組織穿刺標本47例，漿膜腔積液標本10例，淋巴結組織標本3例，有117例進行了成功的體外藥敏檢測，可評價率為96.69%。4例不成功的標本中均來自乳腺癌患者的穿刺組織，標本由空心針進行組織穿刺所得，體積較小，獲得的細胞數太少而放棄檢測。

2.2 檢測方法可行性 實體瘤手術后瘤組織標本及穿刺活組織標本經過消化分離出腫瘤細胞，將細胞懸液接種培養5～7天后對細胞形態進行觀察，可見藥物組比M0對照組細胞數量明顯減少(見圖1)。收集的漿膜腔積液標本經離心，收集0.5ml細胞懸液，按脫落細胞學方法進行常規吉姆薩染色，可觀察到轉移癌細胞(見圖2)，說明不論實體瘤組織標本還是漿膜腔積液標本，用ATP－生物熒光法均能分離得到腫瘤細胞，且藥物組與M0對照組比較存活的細胞明顯減少，由此證明該方法用于體外抗腫瘤藥物敏感試驗是可行的。

圖1 體外抗腫瘤藥敏檢測細胞形態(×200)

圖2 腹水脫落細胞學檢測

2.3 藥物敏感性個體差異性 有效的117例患者選用的均是4～8個方案，其中有單藥和聯合用藥，針對不同的癌標本類型，其敏感藥物不同;同一腫瘤類型的患者的標本，其敏感藥物也不同。部分患者按常規方案無效，但按檢測結果選擇敏感方案后癥狀得以明顯緩解(見圖3)，可見腫瘤患者標本的藥物敏感性存在個體差異。

圖3 ATP－生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性檢測結果圖示

2.4 與臨床治療效果的吻合度調查 對檢測的117例樣本的病人資料進行查閱、追蹤和統計，因部分病人死亡或僅作一次化療患者資料不能進入統計外，可統計患者數量為66例。在該檢測項目指導下用藥后:乳腺癌，17.5%的患者新輔助化療后腫塊明顯縮小，77.2%的患者狀況平穩，5.3%的患者病情出現進行性惡化;卵巢癌，50%的患者CA125明顯降低，37.5%的患者狀況平穩，12.5%的患者病情出現進行性惡化。由以上數據可見，該項目在臨床中的陽性有效率較高，達87.5%以上，與臨床醫生反饋信息吻合度較高。

3 討論

化學治療是治療惡性腫瘤的常規有效手段之一。然而，由于腫瘤對化療藥物的敏感性存在個體差異，以及腫瘤細胞具有多重抗藥性，導致相同藥對同一類型患者的治療效果不同。如果在用藥前缺乏該癌癥患者對化療藥物敏感性和耐藥性的直接實驗依據，在化療方案的制定上就會存在一定的盲目性，而不敏感藥物的治療及化療藥物對機體的損傷及其降低機體免疫功能等可導致化療失敗，甚至危及生命。

ATP－生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(ATP－tumor chemosensitivity assay，ATP－TCA)是目前較為先進的體外藥敏檢測技術，其原理是在有氧和ATP的條件下，熒光酶催化熒光素發出熒光，反應中所釋放的熒光強度與ATP含量呈正相關。ATP是細胞內能量的基本來源，細胞死亡后，胞內的ATP被迅速水解而活細胞中ATP含量基本恒定，因此所測得的熒光強度可以反映活細胞數。從而可根據其判斷抗腫瘤藥物的藥敏結果。腫瘤細胞存活率越低，說明腫瘤細胞對該化療藥物敏感性越高，殺傷力也越強，反之則敏感性越低。

由本室的檢測結果可見，該方法能有效地從組織、胸腹水、淋巴結中分離出腫瘤細胞并進行接種培養，培養一定的時間后，藥物組較M0無藥對照組細胞數明顯減少，與藥敏檢測結果一致。說明用該方法進行體外培養腫瘤細胞的藥敏檢測是可行的。細胞形態和數量的變化與藥物敏感檢測結果一致，可見該檢測方法的準確性較高。近年來，國內外多家研究機構也已應用該方法，檢測了多種惡性腫瘤對化療藥物的敏感性，并且已在世界多個國家對該方法進行了多中心的臨床研究，證實其有較高的臨床符合率，抗腫瘤藥物敏感性試驗的檢測及藥物敏感方案的制定在多種腫瘤治療中取得了明顯的效果。德國科隆大學醫學中心Kurbacher等［1，2］，于 1998 年和 2003 年分別報道了 ATP －TCA指導化療與傳統化療比較和ATP－TCA輔助化療對卵巢癌和乳腺癌治療臨床Ⅱ期試驗，結果表明ATP－TCA指導化療能夠顯著提高臨床療效，延長病人生存期，與傳統化療模式比較差異極為顯著。日本進行的臨床研究也表明ATP－TCA指導化療顯著提高了胃腸道腫瘤的治療效果，延長了病人的生存期［3］。國外在乳腺癌、肺癌等腫瘤上進行的應用ATP－TCA法體外藥敏結果和體內有效率的對比研究表明，體內外的結果比較一致［4－6］。本室所做的檢測結果經查閱病案后也證實，其與臨床治療方案的符合率較高，所得到的各種單藥和聯合用藥的體外藥物敏感性與臨床上觀察的有效率基本一致，部分患者經常規治療失敗后按藥敏方案進行治療能有效控制病情。這些結果均提示，ATP－TCA法可以用于腫瘤的體外藥敏檢測。

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