藿香正氣水微生物限度檢查方法驗證試驗研究

劉 敏

貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004

藿香正氣水是由蒼術、陳皮、厚樸 (姜制)、白芷、茯苓、大腹皮、生半夏、甘草浸膏、廣藿香油、紫蘇葉油等十味組成，具有解表化濕，理氣和中的功效。用于外感風寒、內傷濕滯或夏傷暑濕所致的感冒，證見頭痛昏重、胸膈痞悶、脘腹脹痛、嘔吐泄瀉。在藥品檢驗中，為保證微生物限度檢查方法的科學性及準確性，根據《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查方法的驗證，以保證所采用的檢驗方法適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌計數的測定和控制菌檢查。按照《中國藥典》2010年版的規定對3批藿香正氣水微生物限度檢查法的試驗進行研究，結果報道如下。

1 材料

1.1 培養基 營養肉湯培養基、膽鹽乳糖培養基、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液、MUG培養基、EMB培養基。

1.2 供試品 藿香正氣水 (批號:20110601、20110602、20110603)。

1.3 菌種 大腸埃希菌〔CMCC(B)44102〕、金黃色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕、枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63501〕、白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕、黑曲霉〔CMCC(F)98003〕，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 將上述5株菌的新鮮培養物分別接種至規定培養基中，細菌培養2天，酵母菌培養24h，霉菌培養5天，制備成菌 (孢子)懸液，備用。

2.2 供試液制備 按規定量取供試品10ml，置無菌錐形瓶中，加入pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100ml，充分振蕩使供試品分散均勻，即為1∶10供試液，備用。

2.3 細菌計數、霉菌及酵母菌計數方法的驗證

2.3.1 試驗組 取供試液 (1∶10)1ml過濾，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗量為100ml，沖洗三次，在最后一次沖洗液中加入50～100cfu各試驗菌，過濾，將濾膜取出，菌面朝上，分別貼于營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基上，每株試驗品平行制備2個平皿按照《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法進行培養、計數。

2.3.2 菌液組 取菌液50～100cfu過濾，將濾膜取出，菌面朝上，分別貼于營養瓊脂培養基和玫瑰紅鈉瓊脂培養基上，每株試驗菌平行制備2個平皿，按照《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法進行培養、計數。

2.3.3 供試品對照組 取供試液 (1∶10)1ml過濾，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗量為100ml，沖洗三次，過濾，將濾膜取出，菌面朝上，分別貼于營養瓊脂培養基和玫瑰紅鈉瓊脂培養基上，每株試驗品平行制備2個平皿按照《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法進行培養、計數。

2.3.4 稀釋劑對照組 用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液1ml代替供試液，其它方法同試驗組操作、培養，計數，即得。

2.5 回收率 回收率%=(試驗組平均菌落數－供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數×100%。

2.6 結果判斷 在3次平行試驗中，試驗組的菌回收率均應在70%以上，該驗證方法可用于試驗;若低于70%，應采用適宜的方法消除供試品的抑菌活性，重新進行驗證試驗。

2.7 預試驗 取1∶10供試液1ml/皿、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/皿、0.1ml/皿分別注1皿為一組，每組加入1種試驗菌菌液，共5組。大腸埃希菌白色念珠菌1ml/皿、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/皿、0.1ml/皿的回收率分別為0、2、16、21、35%，金黃色葡萄球菌1ml/皿、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/皿、0.1ml/皿的回收率分別為 3、5、10、12、20%，枯草芽孢桿菌的回收率分別為0、3、15、23、27%，白色念珠菌的回收率分別為13、10、19、29、34%，黑曲霉的回收率分別為4、11、16、22、35%，根據以上預試驗結果來看，回收率低于70%，證明該品種具有較強的抑菌活性能力，應重新采用適宜的方法除菌處理后，進行驗證。根據上述結果來看，該品種驗證方法推向薄膜過濾法試驗，試驗結果見表1。

表1 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證

2.8 控制菌檢查法的驗證

2.8.1 大腸埃希菌檢查 試驗組取1∶10供試液10ml過濾，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗量為100ml，沖洗二次，過濾，將濾膜取放入裝有100ml膽鹽乳糖培養基中，再加入10～100cfu大腸埃希菌，搖勻，按照《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法進行培養、觀察，即得。陰性菌對照組方法同試驗組，以金黃色葡萄球菌作為陰性對照菌。供試品1∶10供試液10ml過濾，用pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗量為100ml，沖洗三次，過濾，將濾膜取放入裝有100ml膽鹽乳糖培養基中，搖勻，按照《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法進行培養、觀察，即得。

2.8.2 結果判斷 陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌;試驗組應檢出試驗菌，該試驗方法成立。

2.8.3 控制菌檢查方法驗證 大腸埃希菌采用培養基稀釋法驗證，試驗組檢出試驗菌，陰性菌對照組未檢出陰性菌對照菌。

2.9 結果 采用經驗證的方法檢查3批藿香正氣水，細菌數均小于10cfu/g，霉菌及酵母菌均小于10cfu/g，未檢出大腸埃希菌。

3 討論

根據預試驗結果，采用常規法 1ml/皿、0.5ml/皿、0.33ml/皿、0.2ml/皿、0.1ml/皿供試液量進行大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的計數驗證，3個批號試驗組的數據中，均出現個別平皿回收菌數與同組數據相差太大，甚至有0回收的現象;將供試液的量制備成1∶20供試液0.5ml/皿、0.2ml/皿以降低供試液的抑菌活性，上述現象未能完全消除;最終將細菌檢查采用1∶10供試液薄膜過濾法，該方法對細菌、霉菌及酵母菌進行計數驗證，同組之間各皿數值趨于一致。

藿香正氣水處方中的部分原輔料及乙醇具有較強的抑菌活性成分。供試品為口服劑，檢驗取樣時難以保證同一試驗組各個平皿中絕對均勻，對試驗菌的回收造成直接的影響。一般情況下，驗證試驗方法的選擇——預試驗，可以在較小工作量的前提下，為正式試驗提供一個合理、可行的試驗方法。但藿香正氣水的金黃色葡萄球菌預試驗，對同一試驗組中可能出現個別平皿回收菌數大大低于同組其它平皿回收菌數的異常現象是不能估計與預計的。

經驗證確認，生產企業在原輔料、生產工藝、檢驗及處方等條件不變的情況下，藿香正氣水的微生物限度檢查可按以下方法進行檢驗。細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證計數采用1∶10供試液1ml薄膜過濾法，沖洗總量為300ml;控制菌大腸埃希菌采用1∶10供試液10ml薄膜過濾法，沖洗總量為200ml驗證，其它按照《中國藥典》2010年版一部附錄XIIIC微生物限度檢查法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 (一部) [M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄.