骨蝕寧Ⅰ號膠囊對激素性股骨頭缺血性壞死TGF－β1表達的影響

李文君 周正新

1.安徽省六安市中醫院，安徽 六安 237006;2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031

激素性股骨頭缺血性壞死 (Steriod－induced avascular necrosis of femoral head簡稱SANFH)是指因為大劑量應用激素而造成股骨頭骨的活成份 (骨細胞、骨髓造血細胞和脂肪細胞)死亡所引起的病理過程。中醫藥療法在早期防治激素性股骨頭缺血性壞死方面具有一定的優勢。本研究通過實驗探討中藥骨蝕寧Ⅰ號膠囊對實驗SANFH兔TGF－β1表達的影響，為骨蝕寧Ⅰ號膠囊在臨床上進一步推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康8月齡的SPF級長耳新西蘭大白兔40只，體重 (2.0±0.5)㎏，雌雄兼備，雌性21只，雄性19只，均由安徽醫科大學動物實驗中心提供。實驗前常規適應性喂養2周。按隨機數字表法分為正常組 (n=4)、骨蝕寧膠囊組 (n=12)、模型組 (n=12)和仙靈骨葆對照組 (n=12)。實驗中對動物的處置均符合中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[1]。實驗地點為安徽醫科大學動物實驗中心及安徽中醫藥大學第一附屬醫院病理科。

1.2 建立SANFH動物模型 采用安徽醫科大學實驗動物中心提供健康8月齡長耳新西蘭大白兔40只，體重 (2.0±0.5)kg/只，雌雄兼用，SPF級。實驗動物自由攝食、飲水，室溫控制在22～25℃。隨機選取4只為正常組，余36只用于造模;每間隔24h于兔耳緣靜脈注射大腸桿菌內毒素，每次50μg/kg，共注射2次，并于第二次注射內毒素24h后肌肉內注射甲基強的松龍20mg/(kg·d)，連續注射3d，每次間隔24h。所有實驗動物每周臀部注射青霉素20萬U，預防感染。制備成典型的骨壞死動物模型。

1.3 給藥方法 造模后將各組置于同等條件下喂養，根據實驗動物用藥換算公式 (Db=Da*Rb/Ra*(Wa/Wb)1/3(其中Db為兔子公斤體重劑量，Da為成人公斤體重劑量，Rb、Ra為體型系數，分別等于0.093、0.1，Wb、Wa為已知動物體重，兔子體重按照平均體重2kg計算，成人體重按照標準體重60kg計算，即Db=0.47g)計算給藥量，按以上公式分別計算出，骨蝕寧組1.41g/kg·d(按體表面積計算，相當于成人服骨蝕寧Ⅰ號方每天用量10g的3倍);對照組藥用仙靈骨葆按1.92g/kg·d(相當于成人每天總量的13.5g/d的3倍)灌服。各用藥組將藥物用蒸餾水配成藥液15ml灌胃，模型組用生理鹽水15ml灌胃，每日灌胃一次。

1.4 標本采集 各組實驗動物分別于第8周取出股骨頭，取股骨頭前禁食、水12小時。耳緣靜脈注射空氣處死動物，取出右側股骨頭，將全部股骨頭負重區沿冠狀面剖開，軟骨下區切取1.0 mm×1.5 mm×1.0mm組織，進行觀察和檢測。

1.5 檢測指標和方法 標本常規HE染色，TGF－β1采用免疫組化分析法進行檢測，石蠟切片 (Leica RM2135，厚度4微米)置入10%中性甲醛中固定，取EDTA200g，加入1000ml雙蒸水，攪拌，制成脫鈣液，保持恒溫25～28℃，浸泡約3～4周，每隔3天更換脫鈣液，以針順利刺入骨頭無阻力為脫鈣終點，然后逐級酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后進行連續切片，TGF－β1免疫組化染色封片后，在熒光顯微鏡10×40倍的鏡下進行觀察，在最大清晰度、最小灰度、最低的失真度下對陽性表達最明顯之處進行數碼攝片，每張標本片分別攝片三次，把攝得的照片輸入電腦，用捷達DP－801分析系統軟件進行TGF－β1的平均光密度進行分析得到數據，把同一張標本片的三張照片所分析得到的數值進行求平均值即為該標本的一個原始數據，把得到的所有數據進行統計分析。

2 結果

第8周模型組家兔與同期對照組、骨蝕寧組TGF－β1表達比較，有統計學差異 (P＜0.05)。(見下表1)

表1 不同組間TGF－β1免疫組化平均光密度統計分析 (±s，n=12)

表1 不同組間TGF－β1免疫組化平均光密度統計分析 (±s，n=12)

注:與對照比較，*P＜0.05;與骨蝕寧組比較#P＜0.05。

組別 第8周0.4719±0.01007對照組 0.5034±0.01600骨蝕寧組 0.5640±0.00743模型組 0.2344±0.14 168*#正常組

3 討論

骨蝕寧膠囊是安徽中醫院大學丁鍔教授在長期治療SANFH的臨床實踐中，遵循《黃帝內經》:“結者散之，留者攻之”的理念，推廣“活血、祛瘀、生新”的治療原則，提出了以活血化瘀、補腎壯骨的基本治則[2]。丁教授認為股骨頭的生理、解剖特點和股骨頭壞死的病機特點，決定了其所形成的“瘀血”并不同于一般的病癥，常規活血化瘀藥物難以直達病所，只有配合蟲類藥物才能剔刮深達筋骨之瘀血與痰濁。在此基礎上，再結合臨床治療脫疽有效藥物的實踐，研制骨蝕寧Ⅰ號方，由穿山甲20g、當歸30g、川芎20g、蜈蚣20g、全蝎20g、土鱉蟲25g、地龍30g、水蛭30g、肉桂10g、姜黃30g、冰片6g組成，共收破瘀通絡之功。

TGF－β是一組具有多功能性蛋白多肽，對多種結締組織具有復雜生物效應的生長因子，其主要來源于淋巴細胞、血小板、巨噬細胞等。尤以在血小板和骨組織含量最為豐富，TGF－β的生物學作用非常廣泛，可以促進各類軟組織損傷修復、促進血管生長[3－4];參與體內許多炎癥反應及組織修復;并參與骨與軟骨的形成。有研究表明TGF－β1在軟骨形成過程中起著重要的調節作用[5]。TGF－β在骨修復中所表現的作用體現為對破骨細胞、成骨細胞、軟骨細胞的代謝調節。TGF－β對細胞代謝調節的作用表現為雙向效應，其既能刺激細胞增殖分化，也能對其抑制。如果周圍環境比如細胞群分化狀態及生長條件不同，則TGF－β對細胞群的作用就顯著不同，但一般來說，低濃度TGF－β起刺激作用，高濃度時起抑制作用。對成骨細胞代謝調節則表現為促進合成Ⅰ型膠原、骨橋蛋白和骨粘連素。此外，TGF－β還可能通過下列2種途徑從而促進細胞外基質合成:①刺激成纖維細胞和成骨細胞中蛋白酶抑制劑的產生(譬如纖維蛋白溶酶原活化劑的抑制劑);②抑制成骨細胞中蛋白酶的產生以及抑制成纖維細胞中琉基酶和金屬蛋白的產生?；趯毎饣|合成的有明顯促進作用，認為TGF－β在創傷愈合、新骨形成、骨組織的修復及重建過程中起重要作用。

短期內大劑量應用激素造成股骨頭區血液供應中斷，局部出現缺血，致使骨的活性成份壞死。有研究表明，在股骨頭壞死的不同階段，組織勻漿TGF－β的表達情況不同，且隨著病情的增加，TGF－β的表達量逐漸減少[6]。骨缺血壞死后隨著機體對壞死區修復的激活，修復細胞產生TGF－β1的量逐漸增多。本研究顯示給予激素性股骨頭缺血壞死實驗兔骨蝕寧治療后，股骨頭局部TGF－β1的表達上調;模型組TGF－β1的表達顯著降低，表達趨勢恰好相反。表明骨蝕寧膠囊可以促進激素性股骨頭缺血壞死模型兔股骨頭局部TGF－β1的表達。組間比較，有統計學差異，骨蝕寧組作用顯著。表明骨蝕寧膠囊可促進激素性股骨頭缺血壞死模兔股骨頭局部TGF－β1的表達，從而促進壞死股骨頭的修復。

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