姜黃素對人鼻咽癌株CNE-2Z細胞凋亡的影響及機制研究

王桂秋

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是高 發惡性腫瘤之一，生長位置深，并有重要血管神經相鄰，不易發現且不易手術切除［1-2］。臨床上多采用放射治療作為NPC首選治療方案，但因其具有中度敏感性、較高分化、預后差及易復發等特點，臨床上也多采用外科切除和藥物干預等方法進行治療［3］。姜黃素(Curcumin，CU)是一種從姜黃根莖(Curcuma L.)中提取的活性成分，具有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗發炎、降血脂［4］作用。其中，姜黃素抑制腫瘤的作用已由眾多實驗中得到證實，同時其抗癌機制已成為國內外研究的熱點［5-8］。本試驗擬采用體外人鼻咽癌株 CNE-2Z細胞模型，探討CU對CNE-2Z中內源性PI3K/Akt通路的影響，為闡明其對NPC的誘導凋亡作用機制提供科學的理論依據。

1 實驗材料

1.1 細胞 人鼻咽癌母系細胞株CNE-2Z細胞購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫。

1.2 藥物與試劑 姜黃素(純度＞96%):Sigma公司。DMEM培養基:Gibco公司。小牛血清:Hyclone公司。胰蛋白酶:Sigma公司。0.25%胰酶:Gibco公司。8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-OHdG)ELISA試劑盒:武漢博士德公司。甲基偶氮唑鹽(MTT):Sigma公司。二甲基亞砜(DMSO):Sigma公司。熒光染料hoechest33342:Biotium公司。PI3K和Akt抗體:武漢博士德公司。蛋白裂解液:武漢博士德公司。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗、二抗:Sigma公司。

1.3 儀器 ZHJH-C1214C垂直流超凈工作臺(杭州匯爾儀器設備有限公司)。CO2培養箱(美國Thermo Fisher公司)。IX71-A21PH倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。JC303A-T電熱恒溫培養箱(成都一恒科技有限公司)。GelDoc XR+凝膠成像系統(美國Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 細胞培養 將胰酶用D-Hank's液配成0.05%的濃度，并置于37℃水浴中孵化。用10 mL含20%血清的培養液重懸CNE-2Z細胞，接種于60 cm2的培養瓶中，放置在培養箱中2 h后，取出，將未貼壁的細胞懸液取出，臺盼藍拒染法計數后，加入培養液調整細胞濃度為5×105個/mL，接種到目的培養器皿中。接種后24 h，用溫的培養基輕輕沖洗培養的CNE-2Z細胞1次，除去未貼壁的細胞，再更換培養液繼續培養孵化。

2.2 分組及給藥 孵化使細胞貼壁后，用含10%小牛血清的DMEM培養基稀釋成不同濃度的CU終濃度(0、20、40、80 μmol/L)，每孔 100 μL，同時設3個平行孔/組。重復實驗5次，獲取平均值數據。應用Graphpad Prism軟件計算IC50(半數抑制率)，即CU干預 CNE-2Z細胞24、48 h后的 IC50值。同時增設對照組。

細胞增殖抑制率 =(OD對照-OD治療)/(OD對照-OD空白)×100%

2.3 指標檢測 MTT法檢測其對CNE-2Z抑制增殖的作用，ELISA法檢測8-羥基-2-脫氧鳥苷(8-OHdG)水平，Hoechst33342染色檢測細胞形態學的變化，Western blotting法檢測PI3K和Akt磷酸化水平。所有實驗步驟均嚴格按照供應商說明書進行操作。

2.4 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件，數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 CU干預對CNE-2Z細胞抑制作用 MTT法數據表明，梯度濃度的CU對CNE-2Z細胞增殖的抑制作用逐漸增加，與空白對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。實驗結果同時提示，CU對CNE-2Z的干預有明顯的劑量和時間依賴關系。見表1。

表1 梯度濃度的CU對CNE-2Z細胞抑制作用(n=10)

3.2 CU干預對CNE-2Z細胞8-OHdG水平的影響

ELISA結果顯示，與空白對照組比較，CU干預組CNE-2Z細胞中8-OHdG表達逐漸增多，差異有統計學意義(P＜0.01)。其中，高劑量CU組表現出明顯的促進8-OHdG表達的效果，體現出一定的劑量依賴關系。見圖1。

3.3 CU干預對CNE-2Z細胞凋亡形態變化的影響 Hoechst33342染色結果顯示，空白對照組中CNE-2Z的細胞核呈現為均勻彌散的淡藍色熒光，核飽滿，胞漿豐富。20 μg/mL濃度CU干預48 h后，開始有部分CNE-2Z細胞核出現碎裂，藍色熒光加強并出現細胞密度減少。40/80 μg/mL濃度CU干預后，CNE-2Z細胞分散，并造成核裂解和染色質聚集，呈現致密較強藍色熒光，并伴隨著凋亡細胞計數的增多。見圖2。

圖1 CU干預對CNE-2Z細胞內源性8-OHdG表達的影響(±s，n=10)

圖2 CU干預對CNE-2Z細胞凋亡的影響(Hoechst33342染色，×200)

3.4 CU干預對CNE-2Z細胞p-PI3K和p-Akt表達的影響 Western blotting分析表明，空白對照組中p-PI3K和p-Akt磷酸化程度較高，處于過激活狀態。經CU干預48 h后，CNE-2Z細胞中p-PI3K和p-Akt表達水平顯著下調，表現出一定的劑量和時間依賴性，與空白對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。見圖3。

圖3 CU干預對CNE-2Z細胞內源性8-OHdG磷酸化水平的影響(±s，n=10)

4 討論

鼻咽癌是我國南方各省份地區常見的惡性腫瘤，在醫學技術迅猛發展的今天，其發病率卻一直居高不下。而且鼻咽癌易擴散、轉移，具有較高的隱蔽性，使得病情診斷存在一定的困難［9-10］。放射治療一直是鼻咽癌的基本治療方法。因鼻咽癌常有局部組織浸潤或顱底骨質破壞，手術常不能徹底清除病灶。早中期鼻咽癌的5年生存率平均在80%左右，而晚期僅為20% ～30%。因此，開發有效的治療手段可以最大程度地降低患者的痛苦和社會的負擔，而中藥活性成分的發掘就成為抗癌治療的潛在策略［11］。在本研究中，MTT實驗結果顯示，CNE-2Z細胞未受藥物干預時不受控制的增殖趨勢，提示抑制癌細胞的增殖可以有助于控制癌癥病情。CU干預有效地抑制了CNE-2Z的增殖，初步說明CU具有抑制CNE-2Z細胞增殖作用。細胞DNA發生損傷時，脫氧鳥苷C-8位點受氧化應激作用8-羥基-脫氧鳥苷(8-OHdG)，造成體循環中8-OHdG濃度異常升高［12］。故檢測細胞群中的8-OHdG代謝水平，可以間接反映癌細胞增殖狀況。本實驗中CU顯著增加8-OHdG的表達水平，提示CU抗細胞增殖作用與誘導CNE-2Z細胞發生氧化破壞 DNA雙鏈有關。同時，Hoechst33342染色觀察到，CU干預的CNE-2Z細胞明顯發生了細胞核病變，進一步說明了CU誘導CNE-2Z細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用。

有研究結果表明，PI3K/Akt通路活性介導下游靶基因/蛋白的表達，進而啟動一系列復雜的細胞級聯反應，調控著細胞的增殖、分化、生長和凋亡的病理生理過程［13-15］。此外，PI3K/Akt通路的激活與癌癥發生發展密切相關［16-17］，研究發現，癌細胞通過增強PI3K與Akt的磷酸化活性，調控細胞周期蛋白的表達，下調腫瘤壞死因子(TNF)的基因轉錄，促進細胞不斷地增殖和生長［18-19］。因此，抑制癌細胞中的PI3K和Ak磷酸化水平是治療癌癥的積極策略［20-21］。本研究中，Western blotting結果表明，CNE-2Z細胞中 p-PI3K、p-Akt表達明顯增多，處于激活狀態。經CU干預后，CNE-2Z細胞中高表達的PI3K和Akt磷酸化水平被有效抑制，提示抑制內源性PI3K/Akt通路是CU抗腫瘤的作用機制之一。

綜上所述，姜黃素具有抑制CNE-2Z細胞增殖的作用，將為其今后在臨床中的應用提供有效的基礎理論依據。但姜黃素是否能有效合理地應用于鼻咽癌患者的臨床治療還需要進一步的研究。

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［1］Colaco RJ，Betts G，Donne A，et al.Nasopharyngeal carcinoma:a retrospective review of demographics，treatment and patient outcome in a single centre［J］.Clin Oncol(R Coll Radiol)，2013，25(3):171-177.

［2］范德生，李澤民，孫寧.姜黃素對人鼻咽癌CNE-2Z細胞侵襲和轉移的體外實驗研究［J］.中國癌癥雜志，2011，21(6):452-456.

［3］Liu H，Chen QY，Guo L，et al.Feasibility and efficacy of chemoradiotherapy for elderly patients with locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma:results from a matched cohort analysis［J］.Radiat Oncol，2013，8(1):70.

［4］鄭芳，鞏紅巖，秦元旭，等.姜黃素預處理對體外循環大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護與抗氧化作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18(5):148.

［5］范昊寧，佟麗，范欽.姜黃素對腫瘤的抑制和放射增敏作用研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(3):333.

［6］姚運紅，余健華，熊暉.姜黃素體內外對鼻咽癌的抗癌作用［J］.腫瘤防治研究，2006，33(7):487-489.

［7］滕達，王婷，劉軍權.姜黃素對γδT細胞和神經膠質瘤細胞的作用比較［J］.實用醫學雜志，2011，27(20):3632-3634.

［8］梁統，陳美，周克元，等.姜黃素誘導低分化鼻咽癌細胞株CNE-2Z 的凋亡［J］.癌癥，2004，23(12):1651-1654.

［9］Li F，Song D，Lu Y，et al.Delayed-type hypersensitivity(DTH)immune response related with EBV-DNA in nasopharyngeal carcinoma treated with autologous dendritic cell vaccination after radiotherapy［J］.J Immunother，2013，36(3):208-214.

［10］陳冬平，齊斌，余意，等.鼻咽癌遠期生存率及預后因素分析［J］.實用醫學雜志，2012，28(12):1999-2001.

［11］Smith ME，Bauer-Wu S.Traditional Chinese Medicine for cancer-related symptoms［J］.Semin Oncol Nurs，2012，28(1):64-74.

［12］Song MF，Li YS，Ootsuyama Y，et al.Urea，the most abundant component in urine，cross-reacts with a commercial 8-OH-dG ELISA kit and contributes to overestimation of urinary 8-OH-dG［J］.Free Radic Biol Med，2009，47(1):41-46.

［13］溫文勝，張哲，謝瑩，等.PI3K-Akt抑制劑誘導人鼻咽癌細胞CNE2凋亡的作用［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010，24(8):370-372.

［14］郭崇勇，柯衛鋒，宋科瑛，等.PI3K/AKT通路參與調控乳腺癌多藥耐藥和侵襲轉移的研究［J］.現代生物醫學進展，2012，12(25):4809-4812.

［15］Memmott RM，Dennis PA.Akt-dependent and-independent mechanisms of mTOR regulation in cancer［J］.Cell Signal，2009，21(5):656-664.

［16］陶冀，黎清煒，石學魁，等.紅花多糖抑制PI3K/Akt信號通路誘導人胃癌細胞凋亡的研究［J］.實用腫瘤學雜志，2012，26(2):119-124.

［17］韓艷艷，李芳.鼻咽癌組織中PI3K、mTOR的表達及臨床意義［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2012，19(5):252-254.

［18］Fresno Vara JA，Casado E，De Castro J，et al.PI3K/Akt signalling pathway and cancer［J］.Cancer Treat Rev，2004，30(2):193-204.

［19］Carnero A，Blanco-Aparicio C，Renner O，et al.The PTEN/PI3K/AKT signalling pathway in cancer，therapeutic implications［J］.Curr Cancer Drug Targets，2008，8(3):187-198.

［20］張洪英，陳軍寶，盧宏柱.PI3K/Akt信號通路在腫瘤血管形成中的作用研究進展［J］.山東醫藥，2012，52(47):98-100.

［21］胡波，李燕，于晶宮，等.pI3K、P-Akt和PTEN在鼻咽癌中的表達及意義［J］.診斷病理學雜志，2009，16(6):459-461.