硒化殼聚糖抑制耐多柔比星K562細胞增殖及對PI-3K/Akt信號通路的影響Δ

鄧守恒，王賢和，袁選舉，李 芳，李林均，陳 萍（湖北醫藥學院附屬人民醫院腫瘤中心，湖北十堰442000）

腫瘤細胞對化療藥物產生多藥耐藥是導致化療失敗的主要原因。近年來，人們圍繞這一難題進行了大量的研究，主要采用的方法有化學藥物干預和基因治療等。維拉帕米和環孢霉素A是被研究最多的化學藥物，但由于其毒副作用大、特異性差，實際應用中效果并不理想。而基因治療也存在著易被DNA酶降解、治療效果不能持久等問題，從而使其臨床應用受限。硒化殼聚糖是將殼聚糖與亞硒酸在酸性條件下，以混合金屬離子為催化劑，通過拼合原理制備成的有機硒，具有高效低毒的特性[1]。硒和砷在化學周期表中屬同族，研究[2-3]證實砷劑能恢復部分耐藥腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，推測硒劑也應具有相似的作用，本文對此進行了研究。

1 材料

1.1 儀器

BMP型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；Mod 550型全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

硒化殼聚糖（本院化學系合成，批號：100601-201016，硒含量：0.8%）；多柔比星（Doxorubicin，DOX）注射用粉末（浙江海正藥業股份有限公司，批號：090606，規格：每支10mg）；MTT、甲基纖維素（美國Sigma公司）；磷酸化絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（p-Akt）多克隆抗體及二抗（美國Santa Cruz公司）。

1.3 細胞

人慢性粒細胞白血病（CML）耐DOX細胞株（K562/DOX）購自中國醫學科學院天津血液病研究所。

2 方法

2.1 細胞培養

K562/DOX細胞培養于含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素和2u/ml谷氨酰胺的RPMI 1640培養基內，在培養體系中加入終質量濃度為0.6μg/ml的DOX以維持其耐藥性，于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養，每隔3～4d傳代1次。

2.2 MTT法檢測細胞抑制率

收集指數生長期的K562/DOX細胞以全培養液稀釋成5×104ml－1的單細胞懸液，接種于96孔板，于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養12h，將細胞分為陰性對照組（RPMI 1640培養基）、DOX組（50μg/ml DOX）和25、50、100、200、400μg/ml硒化殼聚糖組（50μg/ml DOX+相應濃度的硒化殼聚糖），每組4個復孔。各組加樣后繼續培養12、24、36h，每孔加入MTT 10μl，繼續培養 4h，棄上清，加入200μl二甲基亞砜（DMSO），酶標儀檢測570nm波長處光密度（OD）值并計算細胞抑制率。試驗重復3次，比較各組細胞抑制率的差異并計算逆轉倍數。細胞抑制率（%）＝（1－硒化殼聚糖組OD值/陰性對照組OD值）×100%；逆轉倍數＝硒化殼聚糖組半數抑制率/DOX組半數抑制率。

2.3 克隆形成法檢測細胞存活率

參照文獻[4]配制半固體培養基，收集“2.2”項下各組作用12h的細胞，棄去培養液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去藥物，1000r/min離心3min，用含20%胎牛血清的培養液稀釋成7.0×103ml－1單細胞懸液，于預先每孔加入1.2%甲基纖維素培養基1.0ml的24孔板中，加入單細胞懸液50μl，每個濃度設4個復孔。混勻后置于37℃、5%CO2培養箱中孵育12～14d，于倒置相差顯微鏡下計數細胞克隆數，計算細胞存活率（DOX組或硒化殼聚糖組平均克隆數/陰性對照組平均克隆數×100%）。試驗重復3次，比較各組細胞存活率的差異。

2.4 免疫印跡法測定p-Akt蛋白的表達

細胞分組方法同“2.2”項，即分為DOX組（50μg/ml DOX）和100、200μg/ml硒化殼聚糖組（50μg/ml DOX+相應濃度的硒化殼聚糖），作用24h后收集各組細胞，PBS洗2次，裂解，離心，收集上清，即為細胞總蛋白。進行蛋白定量，調節每份樣品蛋白濃度，加等量蛋白于上樣緩沖液中，煮沸，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后轉膜。依次加入p-Akt多克隆抗體及二抗，顯色，拍照，Quanti Scan軟件進行密度掃描分析。以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，比較各組細胞p-Akt蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值比值的差異。

2.5 統計學處理

3 結果

3.1 細胞抑制率和存活率檢測結果

MTT法檢測結果顯示，DOX組對K562/DOX細胞的抑制作用有限，作用12、24、36h的抑制率分別為28.17%、36.72%、40.14%，說明細胞對DOX確實存在耐藥。25～400μg/ml硒化殼聚糖組對K562/DOX細胞的抑制作用明顯高于DOX組，且與濃度、時間呈正相關。25、50、100、200、400μg/ml硒化殼聚糖組作用12h，對K562/DOX細胞的逆轉倍數分別是1.11、1.57、1.68、2.09、2.51，說明硒化殼聚糖能逆轉K562/DOX細胞對DOX的耐藥，對細胞增殖產生了明顯的抑制作用。克隆形成法檢測結果也顯示，DOX與硒化殼聚糖聯用，對細胞克隆形成有明顯的抑制作用，細胞存活率與DOX組比較明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），并呈一定的量效關系。各組作用不同時間后細胞的抑制率見圖1；各組作用12h后細胞的抑制率、逆轉倍數、存活率比較見表1。

圖1 各組作用不同時間后K562/DOX細胞的抑制率與DOX組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig 1 Proliferative inhibitory rate of K562/DOX cells effected for different time in each groupvs.DOX group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

表1 各組作用12h后K562/DOX細胞的抑制率、逆轉倍數、存活率比較（±s，n＝4）Tab 1 Proliferative inhibitory rate，reversal multiple，survival rate of K562/DOX cells effected for 12h in each group（±s，n＝4）

表1 各組作用12h后K562/DOX細胞的抑制率、逆轉倍數、存活率比較（±s，n＝4）Tab 1 Proliferative inhibitory rate，reversal multiple，survival rate of K562/DOX cells effected for 12h in each group（±s，n＝4）

與DOX組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.DOX group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

存活率，%73.21±3.1260.16±4.14＊49.23±3.37＊＊38.49±4.35＊＊25.62±3.29＊＊12.84±1.83＊＊逆轉倍數組別DOX組25μg/ml硒化殼聚糖組50μg/ml硒化殼聚糖組100μg/ml硒化殼聚糖組200μg/ml硒化殼聚糖組400μg/ml硒化殼聚糖組抑制率，%28.17±3.1431.14±2.8744.25±4.18＊47.52±4.69＊＊59.16±5.43＊＊70.97±9.58＊＊1.111.571.682.092.51

3.2 細胞內p-Akt蛋白表達情況

結果顯示，DOX組細胞內p-Akt蛋白呈高表達（灰度比值為0.9917±0.29），細胞經100、200μg/ml硒化殼聚糖作用24h后，細胞內p-Akt蛋白表達的灰度比值分別為（0.4982±0.24）、（0.3714±0.33）。與DOX組比較，100、200μg/ml硒化殼聚糖組細胞內p-Akt蛋白表達明顯降低（P＜0.01），即下調（42.76±2.21）%、（62.17±3.44）%。3組細胞內p-Akt蛋白表達的電泳圖見圖2。

4 討論

圖2 3組K562/DOX細胞內p-Akt蛋白表達的電泳圖Fig 2 Electrophoretogram of the protein expression of p-Akt in K562/DOX cells in 3groups

CML是以費城（Ph）染色體為特征的多潛能干細胞異常的血液系統惡性腫瘤。Ph染色體是由位于9號染色體上的c-abl基因與位于22號染色體上的bcr基因相互異位，產生bcr-abl融合基因，該基因編碼的融合蛋白具有很強的酪氨酸激酶活性，可使融合蛋白自身及細胞內多種底物分子磷酸化，從而激活包括Ras/促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在內的多條細胞信號傳導通路，調控細胞的分裂與增殖，與CML的發病及耐藥密切相關[5]。故而降低CML細胞內融合蛋白含量、抑制其酪氨酸激酶活性、阻斷其可能的細胞信號傳導途徑，已成為當前針對分子靶點進行治療的策略之一。

筆者前期研究結果顯示，硒化殼聚糖可通過下調NF-κB通路對體外培養的CML細胞株K562增殖產生抑制[6]，且可對細胞特征性的P210融合蛋白產生明顯的下調作用[7]，提示硒化殼聚糖可能會對K562耐藥細胞產生逆轉作用。本文中，筆者以DOX誘導建立的K562/DOX為研究對象，采用經典的MTT法和克隆形成法檢測了硒化殼聚糖對K562/DOX細胞體外增殖和存活的影響。結果顯示，單純DOX對細胞的抑制效果有限，而與不同濃度硒化殼聚糖聯用后，DOX對細胞的抑制率明顯高于DOX組，且呈現出一定的量效和時效關系，說明硒化殼聚糖具有逆轉K562/DOX細胞耐DOX的作用。

磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K）是磷脂酰肌醇依賴激酶家族成員，參與細胞增殖、分化和細胞骨架構筑等的調控[8]；Akt是PI-3K最主要的靶酶，與多種細胞活動、物質代謝調節有關，尤其與抑制細胞凋亡、促進細胞生存有密切關系[9]。已有研究[10]表明，部分腫瘤細胞可以通過對負責細胞生長和凋亡的細胞信息傳導通路（如Akt和NF-κB通路）進行調控，從而獲得對化療藥物的耐藥性。本文研究結果則進一步證實了在耐藥的K562/DOX細胞內存在著PI-3K/Akt信號通路的異常激活，而硒化殼聚糖則能通過下調p-Akt水平對PI-3K/Akt信號通路產生抑制進而逆轉K562/DOX細胞對DOX的耐藥。

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