lumican基因在胃癌組織中的表達及其臨床意義

孔凡志 李芳 周文華 周聯明 張光軍 黃忠明 張學利

(1.蘇州大學，江蘇 蘇州 215123;2.上海市奉賢區中心醫院普外科，上海 201499)

近年研究［1］表明，腫瘤微環境在腫瘤的發生、發展和轉移的各個階段中都起著重要的作用。lumican是腫瘤微環境中一種特殊的細胞基質蛋白，廣泛存在于人體組織間質中，在黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌和結直腸癌等多種腫瘤均有異常表達，但關于其在胃癌中的表達及臨床特點的研究較少［2］。本研究采用免疫組化及實時熒光定量PCR等方法觀察了lumican在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達，并探討了其表達水平與臨床病理參數和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2004年12月—2008年1月在上海市奉賢區中心醫院手術治療并經病理確診的胃腺癌患者144例，其中男性95例，平均年齡(63.4±27.2)歲;女性49 例，平均年齡(62.1 ±25.8)歲。根據TNM分期(UICC 1997):Ⅰ期30例，Ⅱ期49例，Ⅲ期57例，Ⅳ期8例。隨訪患者術后5年總生存率。切除40例胃癌患者標本后即速凍于液氮，然后置于-80℃冰箱。樣本及資料收集經上海市奉賢區中心醫院倫理委員會批準。

1.2 實時熒光定量PCR檢測 采用Trizol試劑(日本Takara公司)抽提新鮮胃癌組織及癌旁正常黏膜組織RNA。引物序列(由上海生工生物工程公司合成):lumican上游5'-TGGAGGTCAATCAACTTGAGAA-3'，下游 5'-CAAACGCAAATGCTTGATC-TT-3';18s mRNA上游5'-TGCGAGTACTCAACACCAACA-3'，下游 5'-GCATATCTTCGGCCCACA-3'。PCR 反應條件:預變性95℃ 30 s，PCR反應95℃ 5 s、60℃ 31 s，40 個循環，結束95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。通過2-Ct［Ct=Ct(lumican)– Ct(18s mRNA)］來比較lumican mRNA的相對表達水平。

1.3 免疫組化染色 標本經二甲苯脫蠟，依次梯度乙醇脫水，3%H2O2溶液滅活內源性過氧化物酶，山羊血清封閉非特異性結合，滴加一抗lumican抗體，4℃過夜。復溫后滴加二抗，室溫孵育1 h后，DAB顯色，蘇木素復染，經梯度乙醇脫水后，用中性樹脂膠封。由兩位病理專家對染色結果進行評估，以lumican蛋白陽性反應顆粒定位于細胞膜和細胞質內的染色強度和染色陽性細胞的百分比確定免疫組化結果。采用染色強度和染色陽性細胞百分比雙評分標準對蛋白表達進行評估，(1)依據染色強度等級評分:無色為0分，淺黃或淺褐色為1分，棕黃或褐色為2分，深褐色為3分;(2)依據染色陽性細胞百分比評分:＜25%為1分，25% ～50%為2分，50% ～75%為3分，＞75%為4分;(3)以染色強度和染色陽性細胞百分比的評分總和評分:0～1分為陰性;2～4分為弱陽性;5～7分為強陽性。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件包進行χ2檢驗、單因素和多因素回歸分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，采用Log-rank進行假設檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 lumican蛋白在胃癌組織及癌旁正常黏膜組織的表達 lumican在胃癌組織及癌旁正常黏膜組織的間質中均可有表達，前者分布呈彌漫性或灶性，定位于細胞質或細胞膜，陽性表達構成比率為89.6%(129/144);后者陽性表達構成比率為 8.3%(12/144)，且都為弱陽性，差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.2 lumican mRNA在胃癌組織及癌旁正常黏膜組織的表達 lumican mRNA在40例胃癌組織中表達水平較癌旁正常黏膜組織明顯上調，上調約3.15倍(胃癌組織 lumican mRNA ΔCT=2.58 ±1.62，癌旁正常黏膜組織 lumican mRNA ΔCT=3.95 ±1.34)，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 lumican mRNA在40例胃癌組織與癌旁正常黏膜組織的表達

2.3 lumican蛋白表達與臨床各病理參數的關系lumican表達水平與患者的性別、年齡、淋巴結轉移、遠處轉移、脈管浸潤、癌栓無相關性(P＞0.05);與浸潤深度(P ＜0.01)、腫瘤直徑(P ＜0.01)、腫瘤部位(P＜0.05)和 UICC分期(P＜0.05)明顯相關。lumican表達水平也與浸潤深度顯著相關，侵及深肌層組的表達水平顯著高于侵及淺肌層組。腫瘤直徑＞5 cm組表達水平顯著高于腫瘤直徑≤5 cm組，見表1。

2.4 lumican表達與術后生存率的關系 lumican強陽性、弱陽性和陰性表達組的術后5年生存率分別為86.7%、46.9% 和 30.9%。Kaplan-Meier生存統計結果顯示，lumican表達在各組間的差異有統計學意義(χ2=16.927，P ＜0.01)。單因素分析表明，性別、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤直徑、腫瘤部位、UICC分期、Lauren分型、脈管侵犯、癌栓和lumican表達水平是影響總體生存的因素，見表2。多因素COX模型分析顯示，lumican表達水平、遠處轉移、腫瘤直徑、UICC分期及脈管侵犯是影響總體生存的獨立預后因素，見表3。lumican表達強陽性組、弱陽性組與陰性組比較，強陽性組(RR=4.972，95%CI:1.110 ～20.822)和弱陽性組(RR=5.910，95%CI:1.399 ～24.922)胃癌病死風險較高。

表1 lumican表達與胃癌臨床病理參數的關系

表2 影響胃癌患者術后總體生存率的單因素回歸分析

表3 影響胃癌患者術后總體生存率的多因素回歸分析

3 討 論

lumican蛋白屬于富含亮氨酸低分子蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycan，SLRP)家族［1］。氨基酸序列研究表明，lumican核心蛋白(core protein)存在4個天冬氨酸殘基，能夠進行N-糖基化，其糖基化水平取決于不同組織類型、發展階段和生理條件等。目前研究［3］發現，lumican在多種惡性腫瘤細胞或腫瘤間質中有異常表達，但關于其在腫瘤發生發展中的作用有差異，如在小鼠黑色素瘤模型中其被證實可抑制腫瘤生長和進展;在骨肉瘤研究中發現其表達與細胞分化呈正相關，和骨肉瘤細胞增殖呈負相關。此外，其在胰腺癌間質中的高表達可促進胰腺癌的生長和侵襲，且患者生存期短［4］。

本研究結果顯示，lumican在胃癌組織中陽性表達率為89.6%，顯著高于癌旁正常黏膜組織(8.3%)，且mRNA和蛋白水平均增高，說明其表達上調發生在轉錄和轉錄后水平，提示其可能是潛在的胃癌分子診斷標記物。生存分析結果顯示，lumican表達陽性的患者術后總生存率降低;COX多因素回歸分析表明，lumican表達是胃癌患者術后預后不良的獨立危險因素，但表達調控機制等有待進一步研究。

綜上所述，lumican在胃癌組織中表達與患者的預后明確相關，其表達與腫瘤浸潤深度、腫瘤直徑、腫瘤部位和UICC分期密切相關，lumican高表達患者預后不良，具有一定的潛在臨床意義。但其對胃癌的發生、發展與轉移如何進行調控以及具體途徑還有待進一步研究。

［1］ Nikitovic D，Katonis P，Tsatsakis A，et al.Lumican，a small leucinerich proteoglycan［J］.IUBMB Life，2008，60(12):818-823.

［2］ Brézillon S，Pietraszek K，Maquart FX，et al.Lumican effects in the control of tumour progression and their links with metalloproteinases and integrins［J］.FEBS J，2013，208(10):2369-2381.

［3］ Nikitovic D，Berdiaki A，Zafiropoulos A，et al.Lumican expression is positively correlated with the differentiation and negatively with the growth of human osteosarcoma cells［J］.FEBS J，2008，275(2):350-361.

［4］ Ishiwata T，Cho K，Kawahara K，et al.Role of lumican in cancer cells and adjacent stromal tissues in human pancreatic cancer［J］.Oncol Rep，2007，18(3):537-543.