重組exendin-4類(lèi)似物EW的制備及其體內(nèi)降糖活性分析

吳曉琰 施小梅 陸怡

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院老年科，上海 200040)

理想的抗糖尿病藥物應(yīng)能長(zhǎng)期控制血糖，維持胰腺β細(xì)胞體積并防止其功能減退，保護(hù)正常的進(jìn)食生理反應(yīng)。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是小腸黏膜分泌的多肽，進(jìn)食后濃度迅速增高，半衰期 1.5 ～2.1 min［1］。GLP-1 對(duì) 2 型糖尿病的多重作用包括血糖依賴(lài)性刺激胰島素分泌、增加胰腺β細(xì)胞體積及功能、抑制胰高血糖素分泌及食欲。GLP-1由血漿中的二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4，DPP4)酶解，由腎臟及其他蛋白酶如人中性?xún)?nèi)肽酶24.11(neutral endopeptidase 24.11，NEP24.11)清除，前者為主要途徑。GLP-1受體途徑治療是目前糖尿病治療的新的里程碑［2-3］，包括GLP-1受體激動(dòng)劑及DPP4酶抑制劑。GLP-1受體激動(dòng)劑exendin-4含39個(gè)氨基酸，與GLP-1受體結(jié)合并激活受體，模擬GLP-1的功能。exendin-4肽鏈:HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEW LKNGG PSSGA PPPS(NH2)，其N(xiāo)端的序列為His、Gly，能夠抵抗DPP4，半衰期3～5 h，化學(xué)合成的exendin-4于2005年被 FDA批準(zhǔn)。研究［4-5］證明 exendin-4具有良好的降糖作用，且安全性高，可以單獨(dú)應(yīng)用或與其他口服抗糖尿病藥物聯(lián)用。exendin-4還可使患者體質(zhì)量持續(xù)減輕，并使多項(xiàng)心血管危險(xiǎn)因素如胰島β細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估(homeostasis model assessment for beta cell function，HOMA-B)、血壓、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)下降，使保護(hù)因素高密度脂蛋白(HDL)升高，并且使基線(xiàn)時(shí)升高的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)恢復(fù)正常，不良反應(yīng)少，耐受良好［6］。然而exendin-4較 GLP-1多9個(gè)氨基酸，有免疫源性，40% ～50%患者血漿中檢測(cè)到不同滴度的抗體［7］。

根據(jù)既往研究，本研究設(shè)計(jì)了exendin-4類(lèi)似物EW(PCT/CN2009/001321，exendin-4 的類(lèi)似物)，肽鏈長(zhǎng)度32個(gè)氨基酸。其C末端為OH，長(zhǎng)度及氨基酸組成與母體GLP-1相近，N端的3個(gè)氨基酸為His、Gly、Glu。與 exendin-4 相同，EW 能抵抗 DPP4的酶解，在體內(nèi)具有與exendin-4相似的降糖活性，其結(jié)構(gòu)適合基因工程制備。EW肽鏈:HGEGT YTSDL SSQME EEAVK LFIEW LLNGG PR(OH)。

1 資料與方法

1.1 材料 C57BL/6小鼠(購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)JM109 DH5α，質(zhì)粒 pUC18，限制性?xún)?nèi)切酶(EcoRⅠ、BglⅡ、BamHⅠ及 SalⅠ)，T4 DNA 連接酶，Taq 酶，高保真酶PrimerSTARTM HS DNA Polymerase等(美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn))。exendin-4(美國(guó)Lilly公司生產(chǎn))。測(cè)試及制備 HPLC(美國(guó) Agilent公司生產(chǎn))。飛行質(zhì)譜MALDI-MS(LCQ Deka XP Plus，美國(guó)Thermo公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 基因工程菌 E.coli保存方法 0.4 mL的100%甘油中加入0.6 mL的log中期的非誘導(dǎo)菌長(zhǎng)至飽和的培養(yǎng)基中，充分?jǐn)噭?，置?70℃冰箱中保存。

1.2.2 構(gòu)建EW基因 EW的多肽序列如上，EW基因C-末端設(shè)計(jì)為E.coli的終止密碼;寡核苷酸設(shè)計(jì)中含EcoRⅠ、BglⅡ、BamHⅠ、SalⅠ位點(diǎn)和氨基端的一個(gè)胰蛋白酶酶切位點(diǎn)Arg。采用以下5個(gè)引物，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增:引物1(5’-AATTCCAGATCTCGTCACGGCGAAGGCACCTACA-3’);引物 2(5’-CTGGCTGCTCAGATCGCTGGTGTAGGTGCCTTCG-CCGTGACGAGATCTGG-3’);引物 3( 5 ’-CCAGCGATCTGGCAGCCAGATGGAAGAAGAAGC-GGTTAA-3’);引 物 4(5’-CCAGCCATCAGAACAGTTTAACCGCTTCTTCTTCCAT-3’);引 物 5(5’-ACTGTTCATCGATGGTGTTAACGGCGGCCCGCGTGGATCCT-AG-3’)。

1.2.3 構(gòu)建含8個(gè)拷貝EW的基因序列及感受態(tài)E.coli表達(dá)菌株 將pUC18質(zhì)粒和合成的DNA用EcoRⅠ及SalⅠ酶切，連接并轉(zhuǎn)入E.Coli DH5α中。陽(yáng)性重組質(zhì)粒用PCR的方法驗(yàn)證。證實(shí)的重組質(zhì)粒用BamHⅠ及SalⅠ進(jìn)行酶切;同時(shí)，合成的DNA用BglⅡ及SalⅠ進(jìn)行酶切;連接并轉(zhuǎn)入pUC18質(zhì)粒中。從而得到具有2個(gè)拷貝的EW基因的陽(yáng)性重組質(zhì)粒。不斷重復(fù)，直至重組pUC18質(zhì)粒中包含8個(gè)拷貝EW的基因序列。將pUC18+8EW陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.Coli JM 109菌種，經(jīng)鑒定為陽(yáng)性克隆者，作為菌種保存。

1.2.4 細(xì)菌發(fā)酵 在LB培養(yǎng)基(pH 7.0)300 mL中加入轉(zhuǎn)化體基因工程菌200 μL、25 mg/mL的氨芐西林700 μL、1 mL的50%的甘油以及20%硫酸鎂300 μL，恒溫振蕩器中 200 r/min(37 ℃)，使基因工程菌 E.coli生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至 OD600=0.9時(shí)加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h，取出錐形瓶，4℃ 5000 r/min離心45 min，除去上清液，收集E.coli菌體沉淀。-70℃冰箱保存。

1.2.5 融合蛋白電泳 采用分離膠濃度為12%的SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳。發(fā)酵液未加IPTG誘導(dǎo)、發(fā)酵液加IPTG誘導(dǎo)后8 h以及發(fā)酵液加IPTG誘導(dǎo)后12 h，各取1 mL發(fā)酵液置于塑料EP離心管中，8000 r/min離心5 min，除去上清液，溶解樣品，細(xì)菌裂解物加入1 mL SDS-PAGE樣品緩沖液，煮沸3 min，加入少量尿素晶體增溶，加樣20 μL，進(jìn)行蛋白電泳。按分子量標(biāo)志物、未誘導(dǎo)、誘導(dǎo)8 h、誘導(dǎo)12 h的順序加樣，電泳。

1.2.6 純化融合蛋白 沉淀懸浮于8 mol/L尿素溶液，用勻漿器15000 r/min打勻。溶液4℃15000 r/min離心30 min，上清中含可溶性包涵體。然后將上清液按1∶25稀釋?zhuān)鸬渭尤霃?fù)性緩沖液［1 mol/L Tris-HCl(pH 7.3)，0.25 mol/L 蔗糖，2 mmol/L EDTA］，持續(xù)攪拌，20℃保存24 h。再經(jīng)過(guò)15000 r/min(4℃)離心30 min后取沉淀。加入2 mol/L尿素溶液，洗滌，10000 r/min離心30 min后取沉淀，重復(fù)3次。將沉淀真空冷凍干燥。

1.2.7 融合蛋白的酶切及制備 將300 mg包涵體加入雙蒸餾水200 mL，電磁攪拌，逐滴加入二羧酸，用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值保持7.0，將融合蛋白溶于水，透析，pH 7.5，加入高純度的胰蛋白酶5 mg及5 μL 20%氯化鈣溶液，2 mol/L鹽酸溶液1 mL。30℃ 5 h，持續(xù)電磁攪拌。逐滴加入2 mol/L鹽酸溶液，至pH值3，室溫過(guò)夜，4℃ 10000 r/min離心30 min，取沉淀。制備反相高效液相色譜(reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)1100 series(美國(guó) Agilent公司)，C18柱(φ30×300 mm)。線(xiàn)性梯度20% ～80%乙腈，含0.1%三氟乙酸，30 mL/min，30 min一個(gè)周期。220 nm的每個(gè)峰均進(jìn)行小肽蛋白電泳分析。將沉淀溶于水，每次進(jìn)樣量為5 mL。制備HPLC顯示，24.4 min峰為目標(biāo)峰。收集目標(biāo)峰。真空負(fù)壓冷凍干燥，-70℃儲(chǔ)存。

1.2.8 C57BL/6小鼠的降糖作用 實(shí)驗(yàn)遵循“北京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物照料及福利委員會(huì)”準(zhǔn)則。C57BL/6小鼠(雄性，8周，體質(zhì)量約20 g)飼養(yǎng)在恒溫［(22±2)℃］、12 h照明/12 h黑暗的環(huán)境中。飲水及標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物飲食供應(yīng)。18 h禁食后，毛細(xì)管取10 μL尾靜脈血，轉(zhuǎn)入肝素化微量離心管中，離心后將血漿保存于-20℃、待血糖測(cè)定。血漿葡萄糖測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法。隨機(jī)分為3組，每組10只，組間體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，3組小鼠取空腹血后分別腹腔注射 EW(2 μg EW/100 μL 0.9%氯化鈉溶液)、exendin-4(2 μg exendin-4/100 μL 0.9%氯化鈉溶液)、0.9%氯化鈉溶液(100 μL)之后，即刻及每隔2 h腹腔內(nèi)注射20%葡萄糖300 μL，腹腔內(nèi)注射葡萄糖共4次直至最初給糖后8 h。每次給葡萄糖后20 min取10 μL尾靜脈血，測(cè)定血糖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建含8個(gè)拷貝EW的基因序列 pUC18質(zhì)粒和合成的 DNA 用 EcoRⅠ、BglⅡ、BamHⅠ及 SalⅠ酶切，全序列見(jiàn)圖1，8個(gè)基因串聯(lián)的方法見(jiàn)圖2。

圖1 8個(gè)拷貝的EW基因的全序列

2.2 表達(dá)含8個(gè)拷貝EW基因的融合蛋白 少量轉(zhuǎn)染E.coli，檢測(cè)質(zhì)粒能否有效表達(dá)。加樣量20 μL，采用分離膠12%的SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳。見(jiàn)圖3。轉(zhuǎn)化后的E.coli中EW的表達(dá)量可達(dá)20%。

2.3 發(fā)酵 恒溫振蕩器中于200 r/min 37℃發(fā)酵，4℃ 5000 r/min離心45 min后除去上清液，收集沉淀為基因工程菌菌體。錐形搖瓶培養(yǎng)最終收率是200～250 mg濕細(xì)胞/L發(fā)酵液。

2.4 純化融合蛋白、融合蛋白的酶切及制備HPLC顯示，24.4 min峰為目標(biāo)峰。目標(biāo)峰真空負(fù)壓冷凍干燥。目的多肽EW的制備HPLC圖形見(jiàn)圖4，1為目的峰。

2.5 EW的飛行質(zhì)譜分析 冷凍干燥后白色粉末溶于雙蒸水1 mg/mL，進(jìn)樣量10 μL，行MALDI-MS。目的多肽EW分子量為3581.5 Da。

2.6 血漿葡萄糖測(cè)定 注射前EW、exendin-4及對(duì)照組平均血糖分別為(6.39 ±1.37)mmol/L、(5.87±1.16)mmol/L 及(6.18 ± 1.15)mmol/L(P ＞ 0.05)。4次葡萄糖注射后，對(duì)照組平均血糖逐漸上升至(25.04 ±2.10)mmol/L，而 EW 及 exendin-4 治療組平均血糖濃度分別是(8.54 ±2.10)mmol/L、(6.93±1.84)mmol/L，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但治療組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討 論

化學(xué)合成的exendin-4價(jià)格高昂。我國(guó)華東理工大學(xué)在畢赤酵母中以融合蛋白的形式表達(dá)exendin-4，發(fā)酵需要120 h，融合蛋白以腸激酶切斷純化，目的 exendin-4收率低，約3.15 mg/10 g細(xì)菌。此外，腸激酶是昂貴的蛋白水解酶，不適合工業(yè)用［8］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，32個(gè)氨基酸的類(lèi)似物具有與exendin-4相同的生物活性(另文發(fā)表)。因此本研究將exendin-4縮短至32個(gè)氨基酸并更換部分氨基酸，設(shè)計(jì)了exendin-4類(lèi)似物EW，將EW串聯(lián)后在E.coli中表達(dá)，通過(guò)胰蛋白酶定點(diǎn)切斷獲得重組EW。胰蛋白酶切斷肽鏈的位點(diǎn)在賴(lài)氨酸或精氨酸的羧基端。EW的序列中有1個(gè)賴(lài)氨酸及1個(gè)精氨酸。我們應(yīng)用二羧酸可逆性與賴(lài)氨酸結(jié)合保護(hù)了賴(lài)氨酸的胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)，在后續(xù)的酶切反應(yīng)中，胰蛋白酶僅切斷串聯(lián)表達(dá)的融合蛋白EW8，酶切位點(diǎn)是每個(gè)精氨酸的羧基端。酶切后，調(diào)整pH值以除去二羧酸，從而獲得8個(gè)重組EW。EW收率為70～80 mg/10 g細(xì)菌。這種胰蛋白酶酶切可以用于末端是精氨酸的肽鏈，但肽鏈中不含精氨酸的目的多肽，不論肽鏈中有無(wú)賴(lài)氨酸。精氨酸可以作為一種標(biāo)簽用于串聯(lián)表達(dá)目的多肽。胰蛋白酶在二羧酸對(duì)賴(lài)氨酸保護(hù)后精氨酸羧基端的切斷將會(huì)成為基因工程多肽合成時(shí)一種新的蛋白酶切的方法，這在既往多肽基因工程合成中從未被報(bào)告過(guò)。

重組EW在小鼠體內(nèi)顯示了良好的降糖活性。在我們的降糖作用評(píng)估中，僅1次給 EW及exendin-4，每隔2 h給予糖負(fù)荷，降糖作用保持6 h以上。這表明exendin-4的C-端的7個(gè)氨基酸對(duì)于exendin-4體內(nèi)的生物活性并非必須。

初步研究發(fā)現(xiàn)，EW這一exendin-4類(lèi)似物是一個(gè)很有希望的抗糖尿病藥物，它能通過(guò)基因工程大規(guī)模生產(chǎn)，值得進(jìn)一步研究。

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