超聲波對蛋清蛋白－果糖美拉德反應體系的影響

涂宗財，胡月明，王 輝，* ，劉光憲，黃小琴，張 蘭，鈕培佩

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，生物質轉化教育部工程研究中心，江西南昌330047;2.江西師范大學，江西南昌330022;3.江西省農業科學院農產品加工中心，江西南昌330200)

蛋清蛋白(EW)由于具有較好的凝膠性、起泡性、乳化性等功能特性，作為重要食品原料被廣泛應用于烘焙、肉類制品、餅干制品等食品加工中［1］。但是蛋清蛋白的某些功能特性(如抗氧化性)仍然存在缺陷，需要通過改性來提高其功能特性。眾多學者采用高壓［2］、超聲［1］、輻照［3］、糖基化［4］、磷酸化［5］、酶解［6］等方法對蛋清蛋白進行改性，其中，通過美拉德反應的糖基化來改善蛋清蛋白的理化及功能性質比其他化學法、酶法技術更為綠色、安全、有效。研究表明，蛋白質的糖基化改性可以明顯提高其抗氧化性［7］、溶解性、乳化性、凝膠性、起泡性及熱穩定性［8］。因此，美拉德反應糖基化改性是一種擁有發展潛力的蛋白質改性技術，是拓展蛋白質應用范圍的重要途徑之一。超聲波是指頻率在20Hz以上，人的聽覺閾以外的聲波，具有頻率高、波長短、功率大、穿透力強等特點［9］，它通過機械效應、空化效應、熱效應和化學效應作用于接觸它的物質［10－11］，促使接觸物的物理、化學反應變得快速、均勻。超聲波設備具有操作簡單、運行成本低廉、無食品安全問題等優點，符合綠色食品工業的發展要求［12－13］，探索并擴大其應用范圍是目前的研究熱點。近年來，不少研究表明超聲波能很好的改善蛋白質的功能、理化性質［1，14－17］，但是未見超聲波對蛋白質糖基化反應的影響相關研究。本實驗以蛋清蛋白－果糖體系(EW－F)為研究對象，研究超聲波對反應體系pH、自由氨基、DPPH自由基清除能力、還原力和亞硝酸根離子清除能力的影響，為超聲波在蛋白質－糖類反應體系中的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 購于江西省南昌市江大南路旺中旺超市;D－果糖 上海晶純實業有限公司;鄰苯二甲醛(OPA)、菲洛嗪、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(1，1－diphenyl－2－picryl－hydrazyl，DPPH)、2，2＇氨基－二(3－乙基－苯并噻唑啉磺酸－6)銨鹽(ABTS)美國Sigma公司;乙醇、鐵氰化鉀、亞硝酸鈉等其它試劑均為分析純。

T6新世紀紫外－可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;JD200－3B電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司;DZG－6021P pH計 梅特勒－托利多有限公司;HH－4型數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;KQ－100DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 美拉德反應體系的構建 用0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液配制1%(w/v)的蛋清蛋白溶液，然后用NaOH溶液調節pH至9.0，按蛋清蛋白∶果糖質量比1∶4加入果糖(EW－F體系:H0)，用錐形瓶分別裝取等份體積溶液放入超聲清洗器中，調節超聲功率為200W，控制溫度為 80℃，分別處理 15、30、60、120、240min(超聲 EW－F 體系:U1，U2，U3，U4，U5)。同時取上述同樣溶液(空白 EW－F體系:H1，H2，H3，H4，H5)及同濃度蛋清蛋白溶液(E0，E1，E2，E3，E4，E5)，80℃分別加熱處理 15、30、60、120、240min 作為對照。樣品處理后迅速在冰浴中冷卻使反應終止。

1.2.2 pH的測定 待樣品冷卻后用pH計分別測定各樣液的pH。

1.2.3 自由氨基的測定［18］稱取80mg OPA溶于2.0mL甲醇中，先后加入20%的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液 5mL，0.1mol/L 的硼砂溶液 50mL，β－巰基乙醇200μL，然后用蒸餾水定容到100mL配成OPA試劑。取稀釋4倍的樣液200μL加入到4mL OPA試劑中混勻，避光放置2min后測量340nm處的吸光度。用亮氨酸標曲把吸光度轉換成自由氨基數，自由氨基含量表示為處理后的樣液的自由氨基數占未進行任何處理的蛋清蛋白溶液自由氨基數的百分比。

1.2.4 DPPH自由基清除能力的測定［19］分別取稀釋30倍的樣液2mL，0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液2mL，加入同一具塞試管中搖勻，室溫密閉靜置30min，于517nm處測定吸光度Ai。同樣方法用水代替樣液測得吸光度A0，用乙醇代替DPPH乙醇溶液測得吸光度Aj。按如下公式計算DPPH自由基清除率:

式中:A0為未加樣液時DPPH溶液的吸光度;Ai為加樣液后DPPH溶液的吸光度;Aj為樣液的吸光度。

1.2.5 還原力的測定［7］先后取2.0mL稀釋20倍的樣品溶液，1.4mL蒸餾水，2.0mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2mol/L，pH6.6)和 2.0mL 1%的 鐵 氰 化 鉀(K3Fe(CN)6)溶液于10mL離心管中混合均勻，50℃水浴20min后，加入2.0mL 10%的三氯乙酸溶液，4000r/min離心10min，取上清液2.0mL，加入2.0mL蒸餾水和0.4mL 0.1%的三氯化鐵(FeCl3)溶液，混合均勻，50℃下反應10min，最后測量700nm處的吸光值。吸光值越高表示樣品還原力越強。

1.2.6 在體外模擬胃液條件測樣品的亞硝酸根離子清除能力［20］準確量取3mL稀釋10倍的樣品溶液、2.0mL檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH3.0)和0.1mL 200μg/mL的NaNO2溶液于25mL比色管中，充分混勻后37℃恒溫水浴1h，取出后立即加入2.0mL 0.4%的對氨基苯磺酸，搖勻靜置5min后加入1.0mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，最后加入蒸餾水定容至10mL，靜置15min后于538nm處測定吸光值。按如下公式計算亞硝酸根離子清除率:

式中:A0為未加樣液時測定的吸光值;A為加樣液后測定的吸光值。

2 結果與分析

2.1 反應體系pH的測定

由圖1可知，蛋清蛋白溶液隨著加熱時間的延長，pH略有下降，但變化不大。空白EW－F體系的pH隨著加熱時間的延長不斷下降，而超聲EW－F體系的pH下降更為明顯。這主要是因為羰基在加熱過程中不斷地與堿基基團－氨基進行縮合，使游離氨基被封閉，致使體系pH不斷下降［21］，超聲波處理使得體系pH下降更快，這可能是由于超聲能夠促進羰基與氨基的反應，提高縮合的速率。

圖1 不同條件下蛋清蛋白－果糖體系pH隨時間的變化Fig.1 The pH of egg white protein－fructose system changing with time in various conditions

2.2 反應體系自由氨基的測定

由圖2可知，蛋清蛋白溶液隨著加熱時間的延長，自由氨基含量逐漸下降，加熱240min時降低為原蛋白溶液的84%;空白EW－F體系的自由氨基含量隨著加熱時間的延長下降明顯，加熱4h時為原蛋白溶液自由氨基含量的64%;而超聲EW－F體系的自由氨基含量隨著超聲時間的延長迅速下降，4h時僅剩下原自由氨基含量的36%，這與溶液pH的變化趨勢一致。蛋白質－還原糖體系在發生美拉德反應時自由氨基含量會降低［22］，而在超聲波處理的環境下，蛋清蛋白的自由氨基含量下降的更為迅速，這說明超聲波促進了蛋白質－還原糖體系的美拉德反應進程。

2.3 DPPH自由基清除能力的測定

圖2 不同條件下蛋清蛋白－果糖體系自由氨基含量隨時間的變化Fig.2 Free amino group content of egg white protein－fructose system changing with time in various conditions

由圖3可知，蛋清蛋白溶液的DPPH清除率隨著加熱時間的延長略有下降，在17%～21%;而空白EW－F體系的DPPH清除率隨著加熱時間的延長逐漸增大，特別是在60min后增加迅速;超聲EW－F體系的DPPH清除率在30min之前相對于空白EW－F體系變化不大，在30min以后增加明顯，相對于空白EW－F體系的DPPH清除率增大了20%左右。

圖3 不同條件下蛋清蛋白－果糖美拉德反應體系的DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radical－scavenging activity of egg white protein－fructose Maillard Reaction system in various conditions

2.4 還原力的測定

由圖4可知，隨著加熱時間的延長，蛋清蛋白溶液的還原力變化不大，吸光度在0.04～0.06之間;空白EW－F體系的還原力隨著加熱時間的延長而逐漸增大，240min時溶液的吸光度上升到0.563，還原力約為原蛋清蛋白溶液的十倍左右;而超聲EW－F體系的還原力相對于空白EW－F體系進一步增大，特別是在超聲120min時，相對于空白EW－F體系的還原力增大了50%左右。

圖4 不同條件下蛋清蛋白－果糖美拉德反應體系的還原力Fig.4 Reducing power of egg white protein－fructose Maillard Reaction system in various conditions

2.5 亞硝酸根離子清除能力的測定

由圖5可知，隨著加熱時間的延長，蛋清蛋白溶液的亞硝酸根離子清除率略有升高，但總體變化不大，在29%～40%之間;還原糖具有清除亞硝酸根離子的作用［23］，超聲處理前EW－F體系由于有果糖，亞硝酸根離子清除率升高到49.9%，隨著加熱時間的延長，空白EW－F體系的亞硝酸根離子清除率先升高后降低，在120min時達到最大值;而超聲EW－F體系的亞硝酸根離子清除率隨著超聲時間延長逐漸升高，120min之前與空白EW－F體系相比變化不大，在120min以后增加明顯。

圖5 不同條件下蛋清蛋白－果糖美拉德反應體系的亞硝酸根離子清除能力Fig.5 Nitrites scavenging activity of egg white protein－fructose Maillard Reaction system in various conditions

超聲波能夠提高EW－F美拉德反應體系的抗氧化能力(DPPH自由基清除力、還原力和亞硝酸根離子清除力)，這可能是因為超聲波的氣穴作用以及超聲產生的氣泡生成的大量·OH自由基促進了美拉德早期反應的裂解以及后期反應的聚合［24］，促進了美拉德反應進程，另外·OH自由基還能夠通過促進蛋白的羥基化從而增強蛋白的抗氧化性質［25］。反應體系抗氧化能力增強的另一個原因可能是超聲波的空化作用使蛋白顆粒變小，表面積增大，從而增大了蛋清蛋白與果糖的接觸面積，使美拉德反應更充分，生成更多具有抗氧化性質的美拉德反應產物。

3 結論

本實驗以蛋清蛋白－果糖體系為對象，研究超聲波對反應體系pH、自由氨基、DPPH自由基清除能力、還原力和亞硝酸根離子清除能力的影響。結果表明:超聲波能夠促進蛋清蛋白－果糖反應體系pH和自由氨基含量的降低，促進美拉德反應進程;超聲波能夠提高蛋清蛋白－果糖美拉德反應體系的抗氧化能力(DPPH自由基清除力、還原力和亞硝酸根離子清除力)，使美拉德反應產物具有更強的抗氧化性質。

［1］CarolinaArzeni，OscarE Pérez，AnaM R Pilosof.Functionality of egg white proteins as affected by high intensity ultrasound［J］.Food Hydrocolloids，2012，29:308－316.

［2］Iesel Van der Plancken，Ann Van Loey，Marc E Hendrickx.Foaming properties of egg white proteins affected by heat or high pressure treatment［J］.Journal of Food Engineering，2007，78:1410－1426.

［3］Yau－ Hoong Kuan，Rajeev Bhat，Alias A Karim.Emulsifying and foaming properties of ultraviolet－irradiated egg white protein and sodium caseinate［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59:4111－4118.

［4］Matsudomi N，Nakano K，Soma A，et al.Improvement of gel properties of dried egg white by modification with galactomannan through the maillard reaction［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(14):4113－4118.

［5］Hirofumi Enomoto，Takayuki Ishimaru，Can － Peng Li.Phosphorylation of ovalbumin by dry－heating in the presence of pyrophosphate:Effect of carbohydrate chain on the phosphorylation level and heat stability［J］.Food Chemistry，2010，122:526－532.

［6］Mina Memarpoor－ Yazdi，Ahmad Asoodeh，JamshidKhan Chamani.A novel antioxidant and antimicrobial peptide from hen egg white lysozyme hydrolysates［J］.Journal of Functional Foods，2012，4:278－286.

［7］Xiaoqin Huang，Zongcai Tu，Hui Xiao，et al.Characteristics and antioxidant activities of ovalbumin glycated with different saccharides under heat moisture treatment［J］.Food Research International，2012，48:866－872.

［8］于濱，遲玉杰.糖基化改善蛋清蛋白功能性的研究［J］.中國家禽，2009，31(7):15－18.

［9］宋國勝，胡松青，李琳.超聲波技術在食品科學中的應用與研究［J］.現代食品科技，2008，24(6):609－612.

［10］Dietrich Knorr，MarcoZenker，VolkerHeinz，etal.Applications and potential of ultrasonics in food processing［J］.Trends in Food Science and Technology，2004，15(5):261－266.

［11］C P O’Donnell，B K Tiwari，P Bourke，et al.Effect of ultrasonic processing on food enzymes of industrial importance［J］.Trends in Food Science and Technology，2010，21(7):358－367.

［12］夏瑩，李斌，徐保立，等.蛋清的超聲檢測和超聲化學［J］.食品科技，2010，35(4):294－297.

［13］Weiss J，Kristbergsson K，Kjartansson G T.Engineering food ingredients with high－intensity ultrasound.In:Feng，H，Barbosa－Cánovas，G.V，Weiss，J.(Eds.)，Ultrasound technologies for food and bioprocessing.Springer Science+Business Media，New York，2011.239－285.

［14］Anet Rezek Jambrak，Vesna Lelas，Timothy J Mason，et al.Physical properties of ultrasound treated soy proteins［J］.Journal of Food Engineering，2009，93:386－393.

［15］Ibrahim Gulseren，Demet Guzey，Barry D Bruce，et al.Structural and functional changes in ultrasonicated bovine serum album in solutions［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2007，14:173－183.

［16］Jayani Chandrapala，Bogdan Zisu，Martin Palmer，et al.Effects of ultrasound on the thermal and structural characteristics of proteins in reconstituted whey protein concentrate［J］.Ultrasonics Sonochemistry，2011，18:951－957.

［17］C Arzeni，K Martínez，P Zema，et al.Comparative study of high intensity ultrasound effects on food proteins functionality［J］.Journal of Food Engineering，2012，108:463－472.

［18］Yong－ Guang Guan，Hua Lin，Zhong Han，et al.Effects of pulsed electric field treatment on a bovine serum albumin－dextran model system，a means of promoting the Maillard reaction［J］.Food Chemistry，2010，123:275－280.

［19］Jing H，Kitts D D.Antioxidant activity of sugar－ lysine Maillard reaction products in cell free and cell culture systems［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2004，429(2):154－163.

［20］李桂星，胡曉丹，孫紅男，等.模擬胃液條件下蘋果多酚對亞硝酸鹽的清除作用［J］.食品科學，2011，32(11):1－4.

［21］于彭偉，劉登勇，周光宏.木糖－甘氨酸美拉德反應體系光譜特性和抗氧化性能的研究［J］.食品科學，2012，33(1):54－58.

［22］Lertittikul，Wittayachai，Benjakul，et al.Characteristics and antioxidative activity of Maillard reaction products from a porcine plasma protein－glucose model system as influenced by pH［J］.Food Chemistry，2007，100(2):669－677.

［23］劉曉河，王治寶，梁惠花，等.杜仲多糖清除亞硝酸鹽作用的研究［J］.河北北方醫院學報，2009，26(4):11－12.

［24］Wen－Hui Shi，Wei－Wei Sun，Shu－Juan Yu，et al.Study on the characteristic of bovine serum albumin－glucose model system，treated by ultrasonic［J］.Food Research International，2010，43:2115－2118.

［25］Muthupandian Ashokkumar，Devi Sunartio，Sandra Kentish，et al.Modification of food ingredients by ultrasound to improve functionality:A preliminary study on a model system［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2008，9:155－160.