高產酸乳酸菌的篩選、鑒定和生長特性研究

趙 婧，李 慧，張玉玉，周春麗，宋 弋，李全宏

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，國家果蔬加工工程技術研究中心，農業部果蔬加工重點實驗室，果蔬加工教育部工程研究中心，北京100083)

近年來，隨著益生菌產品日益受到消費者的青睞，乳酸菌作為一種公認的安全性較高的益生菌，其應用越來越廣泛。不僅是乳制品，谷物、蔬菜等都可作為乳酸菌的發酵基質［1］。應用的廣泛性為乳酸菌的品質提出了更高的要求。因此，篩選具有優良性能的乳酸菌，研究乳酸菌的生長特性對于乳酸菌制品的工業化生產有著積極的意義。產酸性能是乳酸菌的一個重要的特性，乳酸菌發酵產酸對改善制品的口感和風味有著積極的意義［2］，高產酸的乳酸菌在乳酸菌制品生產過程中較普通乳酸菌可以縮短發酵時間，提高生產效率，從而降低生產成本，提高經濟效益。國內學者在乳酸菌產酸性能方面作了大量研究，但在高產酸乳酸菌的篩選和生長特性方面的研究還比較少，本研究從實驗室篩選保存的8株優良乳酸菌中進一步篩選出了3株產酸量高且生長良好的乳酸菌。并對這3株乳酸菌進行了分析鑒定和生長特性的研究，為在以后的生產中更好地利用這些優良菌種奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗室分離保存的乳酸菌8株(編號:ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6、ST7、ST8);瓊脂、MRS 肉湯 生化試劑(BR);碳酸鈣、過氧化氫、氯化鈉、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉 分析純(AR);結晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復紅染液;細菌微量生化鑒定管:乳酸桿菌糖發酵鑒定套裝(七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖)、色氨酸肉湯、硝酸鹽肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯、明膠、醋酸鉛培養基 北京陸橋技術有限責任公司;Kovacs靛基質試劑、酚紅、硝酸鹽還原試劑甲乙液 北京陸橋技術有限責任公司。

WH－3微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;YT－CJ－1N型超凈工作臺 北京亞泰科隆實驗科技開發中心;LX－B35L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 合肥華泰醫療設備有限公司;DHP－9082型電熱恒溫培養箱 上海益恒實驗儀器有限公司;PHS－3C型精密pH計 上海精密科學儀器有限公司;WFZ UV－2802H型紫外可見分光光度計 尤尼柯儀器有限公司;XSP－2CA普通光學顯微鏡 上海永亨光學儀器制造有限公司;XMTB恒溫水浴鍋 北京市長風儀器表公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高產酸菌株的篩選

1.2.1.1 初篩 初篩采用鈣溶圈法［3］，分別挑1環活化好的菌株接種于100mL MRS肉湯培養基中，在37℃左右培養24h。將無菌的牛津杯置于加入1%CaCO3的MRS瓊脂平板中央，在牛津杯［4］中分別注入500μL菌液，置于37℃左右培養，待牛津杯中的菌液干后，將牛津杯取下，繼續培養2～3d，測量鈣溶圈直徑大小。選取鈣溶圈直徑較大的菌株進入復篩。

1.2.1.2 復篩 復篩采用酸堿滴定法［5］，分別挑1環活化好的菌株接種于100mL MRS肉湯培養基中，在37℃左右培養48h。取1mL發酵液，用50mL蒸餾水稀釋，以酚酞作指示劑，用0.1mol/L的NaOH溶液滴定至微紅色，記錄用去NaOH溶液的體積。酸度以100mL發酵液消耗NaOH的mol數來表示:

式中:CNaOH指 NaOH標準溶液的摩爾濃度(0.1mol/L);VNaOH指滴定所用的NaOH標準溶液的體積(L)。

選取發酵酸度較高的菌株為高產酸菌株。

1.2.1.3 乳酸定性 以2%乳酸為標準溶液，對篩選出的高產酸乳酸菌發酵液進行紙層析實驗。展開劑為水∶苯甲醇∶正丁醇 =1∶5∶5(v/v/v)，并加入 1% 的甲酸;以0.04%的溴甲酚紫酒精溶液為顯色劑，待層析液揮發之后，向層析濾紙噴灑并計算Rf值［6］。

式中d1為各顯色斑點中心與點樣點之間的距離(cm)，d2為點樣點與展開劑前沿的距離(cm)。

1.2.2 高產酸菌株的鑒定

1.2.2.1 形態學鑒定 將篩選出的菌種分別接種到MRS瓊脂培養基上培養48h，觀察菌落特征，取單菌落，涂片并進行革蘭氏染色和芽孢染色，油鏡下觀察菌體形態。

1.2.2.2 生理生化鑒定 過氧化氫酶實驗、硝酸鹽還原實驗、吲哚實驗、精氨酸水解實驗、明膠液化實驗、硫化氫產生實驗［7］、常見糖發酵實驗(七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖)［8］。

1.2.2.3 16S rDNA分析鑒定 將待檢菌株送于北京三博遠志生物技術有限公司進行16S rDNA序列測定，并用GenBank數據庫進行Blast分析。

1.2.3 菌株的生長特性研究

1.2.3.1 菌株生長曲線的測定 將保存的已鑒定菌株在斜面培養基上活化2次，然后取1環接種于100mL MRS肉湯培養基中活化1次，再分別以3%的接種量接種于200mL MRS肉湯培養基中，在37℃下培養，每隔4h取10mL培養液，測定菌懸液在600nm處的OD值和pH，并繪制生長曲線［9］。

1.2.3.2 菌株最適生長溫度測定 菌株活化方法同1.2.3.1，將活化好的菌株以3%的接種量接種于100mL MRS 肉湯培養基中，分別置于 32、35、37、40、45℃下培養24h，測定菌懸液在600nm處的OD值，確定最適合生長溫度［10］。

1.2.3.3 菌株最適初始pH測定 菌株活化方法同1.2.3.1，將活化好的菌株以3%的接種量接種于100mL MRS肉湯培養基中，調整培養基的初始pH分別為4、5、6、7、8，置于最適溫度下培養24h，測定菌懸液在600nm處的OD值，確定菌株生長最適合的初始 pH［10］。

1.2.3.4 菌株最適鹽濃度測定 菌株活化方法同1.2.3.1，將活化好的菌株以3%的接種量接種于100mL MRS肉湯培養基中，調整培養基的初始鹽(NaCl)濃度值分別為 6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%，調整最適pH，置于最適溫度下培養24h，測定菌懸液在600nm處的OD值，確定最適合的初始鹽濃度［10］。

2 結果與分析

2.1 高產酸菌株篩選結果

2.1.1 初篩結果 根據方法1.2.1.1進行8株乳酸菌的鈣溶圈實驗，由于培養基中添加了1%的CaCO3，所以隨著乳酸菌的生長，乳酸菌產生的酸不斷溶解培養基中的CaCO3，形成的透明圈不斷變大。如圖1所示，在相同的時間內，由于產酸量不同，菌液周圍的透明圈大小產生明顯的差異。用直尺測量各菌株的鈣溶圈直徑，測量結果如表1所示，根據鈣溶圈法的實驗結果，選取鈣溶圈直徑≥1.50cm的菌株進入復篩。因此，進入復篩的菌株為:ST1、ST2、ST3、ST5、ST6、ST7。

圖1 菌株鈣溶圈示意圖Fig.1 Schematic diagram of dissolved calcium circle of strains

2.1.2 復篩結果 根據方法1.2.1.2測定進入復篩的六株乳酸菌最終發酵酸度，結果如圖2所示，菌株ST1、ST3和ST6的產酸量明顯高于其它幾株菌，與鈣溶圈法的結果相一致，三株菌的產酸量(以100mL發酵液消耗 NaOH的 mol數計)均在1.9×10－2mol左右，且ST6＞ST3＞ST1，因此篩選出的高產酸菌株為菌株 ST1、ST3和 ST6。

表1 鈣溶圈法實驗結果Table 1 Results of Ca2+－medium plates screening

表2 發酵液Rf值測定結果Table 2 Rfvalue of the fermentation broth

表3 菌落形態觀察結果Table 3 Results of colony morphology observation

表4 糖發酵實驗結果Table 4 Results of sugar fermentation test

圖2 各菌株產酸量柱形圖Fig.2 Acid production of each strain

2.1.3 乳酸定性結果 根據方法1.2.1.3進行乳酸定性的紙層析實驗，測定乳酸菌標準液和篩選出的三株乳酸菌的Rf值，并進行比較，結果如表2所示:三株乳酸菌發酵液的Rf值與乳酸的Rf值基本一致，表明三株菌的發酵液中都產生乳酸。

2.2 高產酸菌株鑒定結果

2.2.1 形態觀察結果

2.2.1.1 菌落形態觀察結果 初步觀察篩選出的三株乳酸菌的菌落形態，結果如表3所示，三株乳酸菌的菌落都較小，其中菌株ST1稍大一些，菌落以乳白色為主，表面光滑，邊緣整齊，符合乳酸菌典型的菌落特征，但是還無法判斷是何種乳酸菌。

2.2.1.2 鏡檢結果 菌株ST1、ST3和ST6均為革蘭氏染色陽性，無芽孢，無鞭毛，桿狀。初步判斷三株菌均為乳酸桿菌。

2.2.2 生理生化鑒定結果

2.2.2.1 基礎生化實驗結果 基礎生化實驗結果顯示:菌株ST1、ST3和ST6均不產生過氧化氫酶，不分解色氨酸，不液化明膠，不水解精氨酸，不分解含硫蛋白，不還原硝酸鹽，符合乳酸桿菌的特征［11］。

2.2.2.2 糖發酵實驗結果 糖發酵實驗反應結果(表4)顯示，菌株ST1和ST6符合干酪乳桿菌干酪亞種和鼠李糖乳桿菌的反應結果，菌株ST3不符合任一常見乳桿菌屬內種的反應結果。但由于副干酪乳桿菌與干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的親緣關系很近，很難利用傳統的發酵特性來區分它們［12］，所以通過糖發酵實驗還不能確定三株菌的種類，需要通過進一步的16S rDNA分析來鑒定。

2.2.3 16S rDNA分析鑒定結果 通過16S rDNA分析鑒定，菌株ST1的參考物種為副干酪乳桿菌，同源度99%;菌株ST3的參考物種為副干酪乳桿菌，同源度98%;菌株ST6的參考物種為鼠李糖乳桿菌，同源度99%。結合形態觀察、生理生化反應的結果，最終確定菌株ST1和菌株ST3為副干酪乳桿菌，菌株ST6為鼠李糖乳桿菌。

2.3 高產酸菌株生長特性

2.3.1 三株乳酸菌的生長曲線 由菌株生長曲線及pH變化曲線(圖3、圖4)可以看出，菌株ST3和ST6的生長情況基本一致，約4h進入對數期，12h進入穩定期，菌液pH最低達到3.5左右。菌株ST1的生長較ST3和ST6略顯平緩，對數期不明顯，pH下降趨勢也較菌株ST3和ST6平緩，菌液pH最低達到3.7左右。

圖3 菌液OD值隨培養時間變化曲線Fig.3 Changes of OD values of broth with time

2.3.2 三株乳酸菌的最適生長條件

圖4 菌液pH隨培養時間變化曲線Fig.4 Changes of pH values of broth with time

2.3.2.1 菌株最適溫度范圍 由圖5可以看出，菌液OD值在一定范圍內隨著溫度的升高呈現先上升后下降的趨勢，表明溫度過低或過高都不適宜菌株的生長，因此選取菌液OD值≥2.5所對應的溫度范圍為菌株的最適生長溫度范圍，結果如下:菌株ST1和菌株ST3的最適生長溫度為31～37℃，菌株ST6的最適生長溫度為37～43℃。溫度過低或過高都會影響菌株的生長。

圖5 菌液OD值隨培養溫度變化曲線Fig.5 Changes of OD values of broth with temperature

2.3.2.2 菌株生長的最適pH范圍 由圖6可以看出，培養基初始pH過低(＜4)會嚴重影響菌株的生長;在弱酸性的環境中(pH5～7)，菌株的生長較為旺盛;pH大于7，菌株生長明顯減弱。對于菌株ST3和ST6，以菌液OD值≥2.5時pH范圍作為菌株的最適生長pH范圍，均為6～7。對于菌株ST1，以菌液OD值≥2時pH范圍作為菌株的最適生長pH范圍，為5～7。

2.3.2.3 菌株生長鹽濃度范圍 由圖7可以明顯看出，當培養基鹽濃度(NaCl)≤14%時，菌株ST1和菌株ST3的生長幾乎沒有受到影響，菌株ST6受到輕微的抑制。當鹽濃度＞14%時，三株菌的生長均受到明顯的抑制。

3 結論

圖7 菌液OD值隨培養基鹽濃度變化曲線Fig.7 Changes of OD values of broth with salt concentration

對實驗室保存的8株乳酸菌進行了篩選和鑒定，繪制了三株乳酸菌的生長曲線和產酸曲線，結果顯示:篩選出的3株高產酸乳酸菌生長良好，其產酸量最高可達1.98×10－2mol，發酵最終pH最低可達3.5左右，表現出優良的產酸性能。經鑒定，菌株ST1和ST3為副干酪乳桿菌，菌株ST6為鼠李糖乳桿菌。研究了溫度、初始pH、初始鹽濃度對三株乳酸菌生長的影響。得出結論:其中兩株副干酪乳桿菌的最適生長溫度低于鼠李糖乳桿菌，三株菌在pH＜7的弱酸性環境下能較好的生長，培養基初始鹽濃度(NaCl)＞14%會明顯抑制菌株的生長。研究結果顯示，兩株副干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌在菌落特征、生理生化反應以及生長特性方面與鼠李糖乳桿菌都都極為相似，可能是二者親緣關系較近的緣故。副干酪乳桿菌作為一種近年來日益受關注的菌種，在產酸、食品發酵和防腐等方面顯示出巨大的應用潛力。本研究對菌株適宜生長的溫度、初始pH以及初始鹽濃度等條件的測定將為后續研究中乳酸菌發酵過程中條件的控制提供依據。

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