釀酒葡萄中內生霉菌的分離與初步鑒定

時永杰，祁付云，安 婷，劉 婭

(石河子大學食品學院特色果蔬研究中心，新疆石河子 832003)

內生菌廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實和種子等組織細胞或細胞間隙，它們在植物體中相互作用，維持微生態平衡。已有研究表明內生菌具有多種生物學功能，能產生生物活性物質，植物內生真菌不僅能產生抗癌的活性物質［1－5］，還可以產生黃酮、生物堿、萜類、甾類、醌類、環肽、脂肪酸等化合物，這些化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、殺蟲、降糖的功能［6］。新疆處于中國西北邊陲，釀酒葡萄品質優良，生物活性成分豐富。目前尚未見對其中內生真菌的研究報道，因此有必要對新疆釀酒葡萄中的內生菌進行分離純化，從而為了解新疆釀酒葡萄中內生菌的多樣性，探明內生菌與宿主植物相同或相似產生物活性物質的能力，為進一步探討內生菌與宿主植物的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒葡萄 分別于2011年5、8、10月在新疆石河子天珠葡萄酒廠葡萄園，選取3區和4區之間的釀酒葡萄品種“赤霞珠”，取春夏秋三個季節葡萄植株的根、莖、葉及果實的健康組織;葡萄糖、蔗糖、七水合硫酸鎂、硝酸鉀、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、硫酸銨、磷酸氫二鉀、氯化鈣、氯化鐵、碳酸鈣、硫酸鋅、乙醇、次氯酸鈉 均購于天津永晟精細化工有限公司，分析純;瓊脂 北京奧博星生物技術責任有限公司，化學純;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)［7］馬鈴薯200g、葡萄糖 20g、瓊脂 20g、蒸餾水 1000mL、pH 自然;延胡索酸發酵培養基 葡萄糖100g、七水合硫酸鎂10g、磷酸二氫鉀15g、硫酸銨3.0g、磷酸氫二鉀0.15、氯化鈣0.10g、氯化鐵痕跡、碳酸鈣 30～50g、蒸餾水1000mL、121℃滅菌20min;乳酸發酵培養基 葡萄糖150g、七水合硫酸鎂0.25g、硫酸鋅0.44g、磷酸二氫鉀0.3～0.6g、尿素 0.522g、蒸餾水 1000mL、121℃滅菌20min。

BS224－S萬分之一天平 美國 Mettler Toledo公司;BCD－265F冰箱 榮事達集團;LAC－5040S全自動高壓滅菌鍋 韓國LabTech公司;CX21光學顯微鏡 Olympus公司;SW－CJ超凈工作 蘇州安泰空氣技術有限公司;SPX生化培養 寧波市江南儀器廠;SP－752型紫外－可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;DK－98－1恒溫水浴鍋 天津泰斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

樣品采集→表面消毒→組織塊接種培養→內生霉菌分離純化→形態觀察→生理生化測定→初步鑒定

表2 內生霉菌在PDA平板上的菌落特征Table 2 Characterisitics of endogenous mould colony in the PDA plate

1.2.1 樣品采集 采集3區和4區之間健康赤霞珠的根、莖、葉及果實組織，剪下后立即用保鮮膜包好，置于無菌袋中，放入冰箱中4℃下保藏。

1.2.2 樣品的表面消毒［8－10］樣品用自來水沖洗干凈、瀝干，先用5%乙醇浸泡3min、再用10%次氯酸鈉浸泡15～30s進行樣品的表面消毒，最后用無菌水沖洗4遍。各樣品消毒后分別取最后一次沖洗的無菌水做空白實驗，以驗證表面消毒效果。

1.2.3 內生霉菌的分離純化［11］組織塊培養 取消毒后的根和莖用無菌刀片將其切成約1.5cm長的塊，接種時將暴露出來的內側組織切面緊貼PDA培養基上;消毒后的葡萄用無菌刀片切開后按上述方法培養;消毒后的葉片置于無菌研缽中研磨，用無菌鑷子取葉片碎渣接種于PDA培養基上進行培養。培養基置于28℃霉菌培養箱培養3～5d。觀察效果，挑取緊貼組織塊邊緣生長的菌落進行純培養。

1.2.4 葡萄內生霉菌的初步鑒定［12］將純化得到的內生霉菌進行三點培養和載玻片培養，并使用扦片法，通過菌落形態的觀察和顯微特性的觀察，進行初步鑒定。

1.2.5 生理生化指標的測量方法［13］測量碳源氮源對生長速率方法:以完全培養基為基礎，將缺少碳源、氮源的培養基分別盛入100mL三角瓶中，每瓶30mL，每組兩瓶，標記，121℃滅菌20min。冷卻后接入內生霉菌孢子。30℃培養一周，用烘干至恒重的濾紙將培養物過濾，然后將濾得的培養物與濾紙在60℃烘干，再升至100℃，烘干至恒重。以完全培養基的培養物做對照，將完全培養基中濾得培養物連同濾紙的恒重重量，減去濾紙重量作為100%，以求其他培養基的培養物重量百分比，比數越小，說明缺乏的該成分對內生霉菌的生長發育越重要。

2 結果與分析

2.1 內生霉菌的分離純化

對新疆釀酒葡萄“赤霞珠”春夏秋三個季節的根、莖、葉及果實進行組織塊培養，將得到的內生霉菌進行分離純化，得到的菌株數見表1。

由表1可以看出，從釀酒葡萄中共分離到24株內生霉菌，同一季節赤霞珠不同生長部位存在的內生霉菌數量和同一生長部位在不同季節存在的內生霉菌的數量有很大差異。總體上看，赤霞珠不同季節的內生霉菌的數量占總數量的比:夏季(20.8%)＜春季(33.3%)＜秋季(45.8%);赤霞珠不同生長部位的內生霉菌數量占總數量的比:果實(12.5%)＜莖(20.8%)＜根(29.2%)＜葉(37.5%)。

表3 內生霉菌菌落顯微形態Table 3 Microscopy of endogenous mould colony

表1 菌種的分布Table 1 The distribution of bacteria

由于在內生菌分離過程中，內生菌的數量和種類常受到材料的品種、來源、分離部位、分離方法、培養基成分、表面消毒程度以及培養條件等諸多因素的影響，選擇適宜的方法可以分離到盡可能多的菌株。由分離結果可知，利用組織塊法僅從葡萄夏季的葉片中分離得到0株內生霉菌，可能是由于表面消毒處理過度，導致葉片組織內的絕大部分微生物都被殺死之故。

2.2 內生霉菌的初步鑒定

2.2.1 內生霉菌的菌落形態 通過對24株內生霉菌進行三點培養，所得實驗結果見表2。

由表2可以看出，分離出的24株赤霞珠內生霉菌的菌落形態存在一定差異。在春、夏、秋三個季節分離出的菌株的菌落形態有一定的相似性，如墨綠色毛毯狀菌株和綠色粉粒狀菌株;根、莖、葉和果實中均分離出墨綠色地毯狀，說明它在赤霞珠中是普遍存在的;根、莖、葉中均分離出黑色沙粒狀菌株，根和莖中均分離出深綠色粉粒狀菌株。而有些菌株菌落形態與其它的完全不同，如X－P－4的菌絲直立生長，Q－Y－3－5菌落呈喇叭狀，這些都是不常見的霉菌性狀，這些結果表明一些內生霉菌可能具有一定的組織專化性。

2.2.2 內生霉菌的顯微形態及生化實驗數據 由于真菌的屬種眾多，無法對24株內生霉菌逐個鑒定到屬，因此挑選兩株具有代表性且產多酚能力較強的菌株 C－2－J－6和 C－1－G－3進行顯微形態觀察，內生霉菌菌落顯微形態見表3，內生霉菌生化實驗數據見表4。

由表3可以看出C－2－J－6的顯微形態為無色的無隔菌絲，孢囊梗直立，沒有假根，多次分枝，分枝頂端膨大，上生小梗，圓形孢子同時成熟排列成鏈狀，形似一串“分生孢子”;C－1－G－3的顯微形態為無色的有隔菌絲，菌絲垂直生出分生孢子梗，頂端不膨大，無頂囊，經多次分枝，產生幾輪對稱或不對稱小梗，小梗頂端產生分生孢子，總體像“掃帚狀”。

表4 生化實驗數據表Table 4 The data of biochemical tests

通過對 C－2－J－6和 C－1－G－3 進行產多酚能力測定得出:C－2－J－6 在 28℃、pH 為 5.5、接種量達到6%、培養54h，于765nm下測其吸光度值，可達到0.5578;C－1－G－3在 30℃、pH 為 4.8、接種量達到8%、培養 48h，于 765nm下測其吸光度值達到 0.6197［14］。

通過菌落形態和顯微形態，結合《真菌鑒定手冊》，確定兩株能產多酚的內生霉菌［15－16］分別是:C－2－J－6 屬于真菌門(Fungi)藻菌綱(Phycomyeetes)毛霉目(Mucorales)頭珠霉科(Piptoeephalidaceae)星珠霉屬(Syncephalastrum Schroter);C－1－G－3屬于真菌門(Fungi)子囊菌綱(Ascomycetes)真子囊菌亞綱(Euascomycetes)曲霉目(Eurotisles)曲霉科(Eurotiaceae)青霉屬(Penicillum)。

3 結論

3.1 通過對健康無病害的赤霞珠的根、莖、葉、果實組織表面消毒后，進行組織塊培養，分離純化得到24株內生霉菌;不同季節、不同生長部位分離出的內生霉菌的數量關系為:夏季(20.8%)＜春季(33.3%)＜秋季(45.8%)，果實(12.5%)＜莖(20.8%)＜根(29.2%)＜葉(37.5%)。

3.2 通過對C－2－J－6和 C－1－G－32株菌進行產多酚能力的測定可以得出C－1－G－32產多酚的能力高于 C－2－J－6。

3.3 通過菌落形態及顯微形態對兩株具有多酚生產能力的內生霉菌進行初步鑒定:C－2－J－6屬于真菌門(Fungi)藻菌綱(Phycomyeetes)毛霉目(Mucorales)頭珠霉科 (Piptoeephalidaceae)星珠霉屬(Syncephalastrum Schroter);C－1－G－3屬于真菌門(Fungi)子囊菌綱(Ascomycetes)真子囊菌亞綱(Euascomycetes)曲霉目(Eurotisles)曲霉科(Eurotiaceae)青霉屬(Penicillum)。

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