基于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的醬油二次沉淀形成的初步研究

高獻(xiàn)禮，閆 爽，陳燕斌，陸 健*

(1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122;2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫2141222;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122)

據(jù)中國(guó)產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示(http://data.chyxx.com/shpyl/201103/K 79165 A8GP.html)，2011年我國(guó)醬油產(chǎn)量達(dá)662萬(wàn)t，是我國(guó)調(diào)味品和食品工業(yè)的重要組成部分。但隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高和國(guó)外(主要是日本、韓國(guó))高檔次醬油進(jìn)入國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，消費(fèi)者不但要求醬油具有良好的調(diào)味、去腥和上色功能，而且對(duì)醬油的外觀質(zhì)量(如是否有沉淀、長(zhǎng)霉等)的要求也越來(lái)越高。近些年消費(fèi)者對(duì)國(guó)產(chǎn)醬油投訴最多，也是我國(guó)醬油行業(yè)普遍存在的質(zhì)量問(wèn)題，即醬油在儲(chǔ)存和銷(xiāo)售過(guò)程中的沉淀(醬油腳)問(wèn)題，其嚴(yán)重影響了產(chǎn)品的外觀穩(wěn)定性、消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)欲和企業(yè)的形象，導(dǎo)致企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力下降［1－4］。因此，醬油企業(yè)要提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，必須提高產(chǎn)品質(zhì)量，而解決醬油的沉淀問(wèn)題是其需要解決的首要問(wèn)題。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)醬油二次沉淀形成的機(jī)理及影響因素的研究仍然存在爭(zhēng)議或不夠深入。如國(guó)內(nèi)學(xué)者認(rèn)為醬油二次沉淀的產(chǎn)生主要是醬油中的部分疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)引起的，受多糖、脂肪、鹽等的影響較小［5－8］。而日本學(xué)者指出醬油二次沉淀受醬油的熱凝性影響，生醬油中存在促進(jìn)醬油二次沉淀形成的促沉因子。曲霉中的蛋白酶、α－淀粉酶、果膠裂解酶、木聚糖酶等對(duì)醬油的熱凝結(jié)起促進(jìn)作用，其中以堿性和中性蛋白酶的影響最大［9－10］。此外，Pedro等［11］研究結(jié)果顯示非特異性蛋白酶 α－胰蛋白酶在高濃度鹽的作用下能夠生成類(lèi)蛋白，這種類(lèi)蛋白的疏水性比底物高得多，而這種類(lèi)蛋白可以通過(guò)轉(zhuǎn)肽作用富集疏水性氨基酸，生成不溶于水的疏水性肽類(lèi)，濃縮成小顆粒后，形成不溶于水的類(lèi)蛋白。由以上分析可知，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)醬油二次沉淀的主要成分及其機(jī)理進(jìn)行了初步的研究，但對(duì)導(dǎo)致醬油二次沉淀形成的主要成分、影響因素和機(jī)理并未形成被廣泛認(rèn)可的共識(shí)。本文基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，以pearson相關(guān)性分析法研究了醬油各指標(biāo)與醬油二次沉淀形成的相關(guān)性，以T檢驗(yàn)法研究了醬油不同發(fā)酵方式、類(lèi)型、原料、質(zhì)量等級(jí)和產(chǎn)地對(duì)醬油二次沉淀形成的影響，為進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)導(dǎo)致醬油二次沉淀形成的主要成分、機(jī)理及影響因素提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和方法支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料見(jiàn)表1。硫酸銅、亞甲基藍(lán)、酒石酸鉀、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、硝酸銀、鉻酸鉀、甲醛溶液、考馬斯亮藍(lán)G－250、乙酸鎂、四硼酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈣、檸檬酸、Tris、SDS、過(guò)硫酸銨、溴酚藍(lán)、無(wú)水乙醇、冰醋酸 均為分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;Kjeitec2300凱氏定氮儀 瑞典FOSS分析儀器有限公司;WFZ UV－2100紫外分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;5415D高速離心機(jī) 德國(guó)艾本德(Eppendorf)股份公司;Freezone 4.5真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將表1中各醬油樣品常溫下靜置7d以上，取上清液進(jìn)行以下理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.1 pH的測(cè)定 FE20 pH計(jì)直接測(cè)定。

1.2.2 還原糖和總糖的測(cè)定 還原糖的測(cè)定方法參照GB/T 5009.7－2003法。總糖的測(cè)定方法如下:吸取樣品2～10mL(控制樣品總糖含量 1～2g/L)于500mL容量瓶中，加水50mL和6mol/L鹽酸5mL，68～70℃水浴加熱15min。冷卻后加入甲基紅指示液2滴，用200g/L的NaOH溶液滴定至紅色消失(近中性)。加水定容、搖均、冷卻后備用。其他步驟參照還原糖測(cè)定方法GB/T 5009.7－2003。

1.2.3 NaCl的測(cè)定 NaCl含量的測(cè)定方法參照GB/T 5009.39－2003。

1.2.4 氨基酸態(tài)氮和總氮的測(cè)定 氨基酸態(tài)氮和總氮的測(cè)定方法分別參照GB/T 5009.40－2003和微量凱氏定氮法GB 5009.5－85。

1.2.5 無(wú)鹽固形物含量的測(cè)定 無(wú)鹽固形物含量的測(cè)定方法參照GB 18186－2000方法。

表1 醬油樣品基本信息Table 1 Information of soy sauce samples

1.2.6 沉淀制備方法 醬油二次沉淀制備方法參照文獻(xiàn)［12］，修改如下:將 500mL醬油搖均后在4500r/min、4℃ 下離心 30min，去除上清，分別用10mL上清洗滌沉淀3次并轉(zhuǎn)入50mL離心管中。同樣在4500r/min、4℃下離心30min，棄上清，收集沉淀。將收集的沉淀在－40℃下冷凍4h，樣品進(jìn)行抽真空冷凍干燥，最后在105℃烘干至恒重得醬油二次沉淀。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)定3次，取其平均值。運(yùn)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行 Pearson相關(guān)性分析和Independent－Samples T Test分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 醬油理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

由表2可知，25種市售醬油的pH、總糖、還原糖、NaCl、總氮、氨基酸態(tài)氮、無(wú)鹽固形物及二次沉淀含量的變化范圍分別為4.18～5.29、17.23～78.32g/L、10.76～45.65g/L、11.00～19.45g/100mL、0.28～2.04g/100mL、0.15～1.48g/100mL、7.86～34.32g/100mL、0.18～2.98g/L。其中25種市售醬油二次沉淀含量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差為:(0.90±0.74)g/L。

表2 醬油中各理化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of physicochemical indices of soy sauces

2.2 醬油理化指標(biāo)與二次沉淀形成的相關(guān)性分析

由表3可知，經(jīng)pearson相關(guān)性分析得出醬油二次沉淀的形成與醬油中總糖、總氮和無(wú)鹽固形物含量呈顯著性相關(guān)，而與醬油pH及還原糖、NaCl、氨基酸態(tài)氮含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的相關(guān)性。曾新安等［5］和張志航等［7］通過(guò)理化分析得出蛋白質(zhì)和多糖是醬油二次沉淀的兩類(lèi)主要成分，本文通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析證明醬油中總氮和多糖含量與醬油二次沉淀的形成密切相關(guān)。此外，蛋白質(zhì)和多糖是醬油無(wú)鹽固形物的主要組成部分，其含量與醬油二次沉淀形成密切相關(guān)具有理論上的合理性。此外，曾新安等［5］的分析結(jié)果表明醬油二次沉淀的形成與NaCl含量及pH無(wú)關(guān)，這與本文基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原理分析的結(jié)果一致。

2.3 影響醬油二次沉淀形成因素的分析

由表4可知，不同質(zhì)量等級(jí)醬油的二次沉淀含量存在較大差異，如特級(jí)醬油分別比一級(jí)/二級(jí)醬油和三級(jí)醬油二次沉淀含量高148.89%和21.74%，說(shuō)明質(zhì)量等級(jí)對(duì)醬油二次沉淀含量具有較大影響，即質(zhì)量等級(jí)越高、總氮含量越高，其二次沉淀含量可能越高(本研究一級(jí)/二級(jí)醬油樣本偏少，對(duì)分析結(jié)果可能有一定的影響)。與東北/日本產(chǎn)醬油相比，華南、華東、華北產(chǎn)醬油二次沉淀的含量分別比東北/日本產(chǎn)醬油二次沉淀含量高 90.57%、94.34%、64.15%，說(shuō)明不同產(chǎn)區(qū)對(duì)醬油二次沉淀的形成有明顯的影響。可能的原因?yàn)槲覈?guó)東北地區(qū)及日本與我國(guó)的華南、華東和華北地區(qū)存在較為明顯的年平均氣溫差異(http://info.datang.net/Z/images/6213－b01.jpg)，而發(fā)酵溫度對(duì)醬油二次沉淀的形成具有重要影響［4，13］。此外，由表 4 可知，不同發(fā)酵方式和主要生產(chǎn)原料對(duì)醬油二次沉淀的形成也存在明顯的影響。如低鹽固態(tài)醬油比高鹽稀態(tài)醬油二次沉淀含量高49.37%;以大豆為主要原料生產(chǎn)的醬油比以豆粕為主要原料生產(chǎn)的醬油的二次沉淀含量高51.95%。但不同類(lèi)型醬油(老抽和生抽)之間的二次沉淀含量差異較小(15.12%)。

表3 醬油各理化指標(biāo)與醬油二次沉淀形成相關(guān)性分析結(jié)果Table 3 Analysis results of correlation between physicochemical indices and secondary sediments of soy sauces

表4 醬油二次沉淀含量經(jīng)T Test檢驗(yàn)分析結(jié)果Table 4 Results of secondary sediment contents of soy sauces analyzed by T Test

3 結(jié)論

本文基于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析法研究了醬油pH及總糖、還原糖、NaCl、總氮、氨基酸態(tài)氮、無(wú)鹽固形物含量與醬油二次沉淀形成的相關(guān)性及影響醬油二次沉淀形成的因素。得出如下結(jié)論:

3.1 醬油二次沉淀的形成與醬油中總糖、總氮和無(wú)鹽固形物的含量顯著性相關(guān)。

3.2 醬油發(fā)酵方式、主要原料、質(zhì)量等級(jí)和產(chǎn)地對(duì)醬油二次沉淀的形成具有較大影響，而醬油類(lèi)型對(duì)醬油二次沉淀的形成無(wú)明顯的影響。

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