小麥胚芽清蛋白提取工藝及分子量測定

刁大鵬，黃繼紅，，* ，李 錦，惠 明，侯銀臣

(1.河南工業(yè)大學(xué)，河南鄭州450001;2.河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所，河南鄭州450000;3.河南鄲城財鑫糖業(yè)有限公司，河南鄲城477150)

小麥胚芽占小麥籽粒的2%～3%，是小麥的生命源泉，是整個麥粒營養(yǎng)價值最高的部分［1］，被營養(yǎng)學(xué)家譽為“人類天然的營養(yǎng)寶庫”［2－3］。麥胚中的總蛋白含量高達30%左右，是一種完全蛋白，它含有人體必需的 8 種氨基酸［4－5］，占總氨基酸的 34.74%［6］，而且必需氨基酸的相互比值與FAO/WHO頒布的模式基本接近［7－8］。小麥胚芽各種蛋白質(zhì)中，清蛋白評分最高，具有最高的蛋白質(zhì)效率比(PER)、體外消化率(IVPD)和較好的氨基酸組成，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)［9－10］。小麥胚芽雖然具有高的營養(yǎng)價值，但因其高色澤和脂肪酶含量，混入面粉會降低面粉白度，不利于面粉貯藏，在制粉中被去除掉［11－12］，造成資源的嚴(yán)重浪費。為充分地開發(fā)利用小麥胚芽清蛋白資源，朱科學(xué)、紀(jì)瑩優(yōu)化了清蛋白提取pH、料水比、溫度、時間［13］，周惠明研究了水溶性蛋白中的糖蛋白性質(zhì)［14－15］。本文對小麥胚芽清蛋白提取時的粉碎粒度、料水比、溫度、時間進行了研究，并在此基礎(chǔ)上制得蛋白含量較高的清蛋白粗粉及精粉，通過 SDSPAGE凝膠電泳測定了組成清蛋白亞基分子量，為進一步開發(fā)清蛋白提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮小麥胚芽 河南財鑫集團第二制糖廠;BM523蛋白電泳Marker 生工生物工程有限公司;硫酸銨、冰乙酸、氯化鈉、Tris、Acr、Bis、SDS、TEMED、甘氨酸、過硫酸銨、蔗糖、巰基乙醇、溴酚藍、考馬斯亮藍、甲醇 均為分析純。

THZ－100B搖床 上海－恒科學(xué)儀器有限公司;L－55臺式低速大容量離心機湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司;XY－200型高速多功能粉碎機 浙江省永康市松青五金工具廠;反滲透膜系統(tǒng) 福建賽普特膜技術(shù)有限公司;DYY－III型電泳槽、DYY－III2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠;23－10箱式電阻爐 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;LGJ－10臺式冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水分含量測定 按GB 5009.3－2010。

1.2.2 灰分測定 按GB 5009.4－2010。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測定及提取率計算 蛋白質(zhì)含量測定:按 GB5009.5－2010。

蛋白質(zhì)提取率(%)=提取液中蛋白質(zhì)含量/小麥胚芽中蛋白含量×100

1.2.4 油脂含量測定 按GB/T10359－2008。

1.2.5 小麥胚芽滅酶 小麥胚芽放于80℃烘箱10min滅酶。

1.2.6 小麥胚芽脫脂 小麥胚芽粉碎粒度至0.42mm，放入玻璃容器中，按料液比1∶1加入正己烷，保鮮膜封口，浸提4h，每30min攪拌一次。浸提結(jié)束，進行抽濾。抽濾后液體部分蒸發(fā)溶劑提油，脫脂麥胚平鋪白色瓷盤，放入通風(fēng)廚內(nèi)脫溶12h備用。

1.2.7 清蛋白提取實驗 粉碎粒度對提取率影響:將脫脂麥胚粉(粉碎粒度0.42mm)繼續(xù)粉碎至粒度0.178、0.125、0.096、0.074mm，按 1∶11 料液比分別裝入500mL三角瓶，調(diào)pH7.0。每個三角瓶裝胚芽干基40g，蒸餾水 280mL，于 20℃ 搖床 100r/min提取30min，迅速抽濾，測定濾液蛋白質(zhì)含量，計算提取率。每個實驗平行三次取平均值。

溫度對提取率影響:取粒度為0.074mm小麥胚芽粉，按1∶11料液比分別裝入500mL三角瓶，調(diào)pH7.0。每個三角瓶裝胚芽干基 40g，加蒸餾水280mL，于 10、20、30、40、50℃ 搖床 100r/min 提取30min，迅速抽濾，測定濾液蛋白質(zhì)含量，計算提取率。每個實驗平行三次取平均值。

提取時間對提取率影響:取粒度為0.074mm小麥胚芽粉，按1∶11料液比分別裝入500mL三角瓶，調(diào)pH7.0。每個三角瓶裝胚芽干基40g，加蒸餾水280mL，提取溫度30℃，搖床100r/min，分別提取10、20、30、40、50min，迅速抽濾，測定濾液蛋白質(zhì)含量，計算提取率。每個實驗平行三次取平均值。

提取料液比對提取率影響:取粒度為0.074mm小麥胚芽粉，按 1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15 料液比分別裝入500mL三角瓶，調(diào)pH7.0。每個三角瓶裝胚芽干基40g，加蒸餾水 280mL，提取溫度 30℃，搖床100r/min，提取30min，迅速抽濾，測定濾液蛋白質(zhì)含量，計算提取率。每個實驗平行三次取平均值。

1.2.8 正交實驗 以粉碎粒度、提取溫度、提取時間、提取料液比四因素，設(shè)計4因素3水平正交實驗。因素與水平見表1。

表1 小麥胚芽清蛋白提取工藝正交實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experimental of wheat germ albumin extraction technology

1.2.9 清蛋白粉制作 將清蛋白提取液進一步加工可得兩種蛋白含量不同的清蛋白粉:反滲透膜脫鹽至5%以下，噴霧干燥，得到清蛋白粗粉;加入一定量硫酸銨，配成硫酸銨飽和溶液，沉淀出清蛋白，4000r/min離心10min后，取沉淀，將沉淀在水中溶解后，用反滲透膜脫鹽至5%以下，得到清蛋白濃縮液，冷凍干燥得清蛋白精粉。

1.2.10 清蛋白電泳 對清蛋白提取液進行SDSPAGE凝膠電泳分析，確定其分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮小麥胚芽滅酶脫脂前后成分

小麥胚芽滅酶脫脂前后成分變化如表2所示，脫脂前油脂含量為10%，脫脂后為1.2%，脫脂效果明顯。其它成分變化不明顯。

表2 小麥胚芽成分Table 2 Composition of wheat germ

2.2 不同粒度對小麥胚芽蛋白提取率的影響

由圖1可知，隨麥胚粒度增大，清蛋白提取率減小。由于粉碎粒度越小，比表面積越大，清蛋白浸出越充分。粒度由0.125mm增大到0.42mm時，提取率下降明顯，而由0.074mm增大到0.125mm時，提取率下降不明顯。因為粉碎粒度越小，能耗越大，因此選取的粉碎粒度為0.125mm。

圖1 粒度對提取率影響Fig.1 The effect of grain size on the extraction ratio

2.3 不同溫度對小麥胚芽蛋白提取率影響

由圖2知提取溫度從10℃升至30℃過程中，提取率顯著增加。溫度由30℃繼續(xù)升高，提取率急劇下降，是因為超過30℃，接近了清蛋白變性溫度，部分清蛋白變性沉淀而留于濾渣中。因此宜選取提取溫度為30℃。

圖2 提取溫度對提取率影響Fig.2 The effect of temperature on extraction ratio

2.4 提取時間對小麥胚芽蛋白提取率的影響

由圖3可知，前30min內(nèi)，延長提取時間，蛋白提取率明顯增加，超過30min，提取時間繼續(xù)延長，提取率幾乎不變。為節(jié)約時間起見，宜選取提取時間為30min。

圖3 提取時間對提取率影響Fig.3 The effect of time on extraction ratio

2.5 料液比對小麥胚芽蛋白提取率的影響

由圖4可知，料液比由1∶7到1∶11過程中，清蛋白提取率增加明顯。液體含量繼續(xù)增加，提取率增加不明顯，逐漸保持不變。為節(jié)水起見，宜選用料液比為 1∶11。

圖4 提取料液比對提取率影響Fig.4 The effect of solid－liquid ratio on extraction ratio

2.6 正交實驗設(shè)計

根據(jù)表1因素與水平設(shè)計L9(34)正交表及實驗數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 小麥胚芽清蛋白提取工藝正交實驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results of wheat germ albumin extraction technology

由表3可知，對清蛋白提取影響由大到小各因素排序為溫度＞時間＞料液比＞粒度。由于粉碎粒度對提取率影響與其它三項相比不明顯，且增加粉碎粒度需增加能耗和時間，因此粉碎粒度選擇0.125mm。綜合以上結(jié)果得到清蛋白提取的最佳因素配比應(yīng)為A3B3C3D3即麥胚粉碎粒度0.125mm，提取溫度30℃，提取時間30min，提取料液比1∶11，在此條件下進行驗證實驗提取率可達29.2%。

2.7 清蛋白粗粉

1kg脫脂小麥胚芽制得清蛋白粗粉290g，其中蛋白含量37%。其它成分大多為可溶性糖。

2.8 清蛋白精粉

1kg脫脂小麥胚芽制得清蛋白精粉148.5g，其中蛋白含量高達72%。蛋白中包含30%糖蛋白，糖蛋白含糖基占糖蛋白總重的43%。

2.9 清蛋白SDS－PAGE電泳

由SDS－PAGE電泳圖5可知，清蛋白共呈現(xiàn)7條譜帶。由蛋白Marker分子量對數(shù)與相對遷移率(此處相對遷移率指電泳譜帶到電泳前沿的距離，清蛋白譜帶相對遷移率與之相同)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6所示，得分子量對數(shù)與相對遷移率關(guān)系式y(tǒng)=0.0179x+0.6441，R2=0.9846。將清蛋白條帶相對遷移率帶入公式，得到清蛋白分子量對數(shù)，進而得到清蛋白分子量見表4。清蛋白7條譜帶分子量由小到大排列分別為10.47、14.45、20.89、26.92、38.02、52.48、85.11ku。

圖5 清蛋白SDS－PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.5 Albumin SDS－PAGE polyacrylamide gel electrophoresis figure

圖6 清蛋白SDS－PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量對數(shù)與相對遷移率曲線圖Fig.6 SDS electrophoretic relative molecular mass of the logarithmic and relative migration rate curve fractions

表4 SDS－PAGE清蛋白分子量表Table 4 SDS－PAGE albumin molecular weight table

3 結(jié)論

通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化了小麥胚芽清蛋白提取最佳工藝條件，即粉碎粒度0.125mm。提取溫度30℃，提取時間30min，提取料液比1∶11。此條件下清蛋白提取率達29.2%。

將清蛋白提取液純化噴霧干燥得清蛋白粗粉，清蛋白含量37%;對清蛋白提取液進一步提取純化后真空冷凍干燥得清蛋白精粉，清蛋白含量72%。

通過對清蛋白提取液進行SDS－PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳得到7條譜帶，分子量由小到大分別為10.47、14.45、20.89、26.92、38.02、52.48、85.11ku。

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