云南種植瑪咖中多糖提取工藝的優化研究

郝利民，張建春，魯吉珂，，姜月蒙，于瀝博，白 冰

(1.總后軍需裝備研究所，軍用漢麻材料研究中心，北京100027;2.鄭州大學生物工程系，河南鄭州450001)

瑪咖(Lepidium meyenii Walp.，Maca)，又名秘魯參，是十字花科獨行菜屬一年生或兩年生草本植物，其營養主要儲藏于蘿卜樣塊根［1］。瑪咖原產于秘魯中部的安第斯高寒強風山區，具有悠久的栽培和食用歷史，傳統上主要用于抗疲勞和提高生育力等［2－3］。瑪咖除含有豐富的碳水化合物、蛋白質、脂肪、維生素和微量元素等營養成分外，還含有多糖、芥子油苷、瑪咖烯、瑪咖酰胺等多種活性成分［4－6］。2003年，我國云南引種瑪咖成功，分析顯示云南種植瑪咖根營養成分豐富，與秘魯瑪咖相當，具有較高的開發價值［3，7］。瑪咖具有抗疲勞、抗衰老、抗氧化、抗應激、抗焦慮、抗腫瘤、調節內分泌及提高生殖細胞活力等多種生理功能［5，8］。2011 年，我國衛生部批準瑪咖粉為新資源食品。多糖是由10個以上單糖聚合而成的天然高分子化合物，具有多種生物學功能，如抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和免疫調節等［9］。國外關于瑪咖多糖的研究較少，國內研究主要集中在多糖分析和提取純化工藝方面。陳燕青等［10］用水提醇沉法從瑪咖根干粉中提取瑪咖多糖，得到其瑪咖多糖含量為2.55%;正交實驗優化得到水提瑪咖多糖最優工藝條件為100℃、120min、料液比1∶40，瑪咖多糖提取率為 12.32%［11］。浦躍武等［12］用正交實驗得到超聲波提取瑪咖多糖的最佳工藝條件為:料液比1∶20，20min，50℃，功率 200W，多糖的提取率為74.4%。目前不同研究組測得多糖含量差異較大，且缺乏對云南種植瑪咖中多糖含量的優化研究。本研究以云南種植瑪咖根干粉為原料，對瑪咖干根中多糖提取工藝進行優化，為瑪咖功效物質的提取制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑪咖干根 云南麗江格林恒信生物種植有限公司，粉碎粒度150目;α－淀粉酶 生化試劑，北京索萊寶科技有限公司;葡萄糖、甲醇、乙醇、正己烷、濃硫酸、苯酚 均為分析純。

Beckman高速離心機 美國Beckman公司;UV－1700紫外分光光度儀 日本Shimadzu Corporation;精密pH計(PHS－3C)上海精密科學儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫療儀器廠;SHZ－D(Ⅲ)循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司;電熱鼓風干燥箱 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取溶劑選擇 分別稱取瑪咖粉1.00g，置于磨口錐形瓶中，按1∶20料液比分別加入20mL提取溶劑(超純水、甲醇、乙醇和正己烷)，室溫浸提24h;水浸提液真空過濾，稀釋定容至100mL，待測;甲醇、乙醇和正己烷浸提液真空過濾，濾液減壓蒸餾濃縮，浸膏用超純水定容至100mL，待測。

1.2.2 瑪咖多糖的提取 稱取瑪咖粉10.00g，置于磨口錐形瓶中，按料液比1∶20加入超純水，90℃水浴浸提120min，3000r/min離心10min，收集上清液，減壓蒸餾濃縮，調pH為7，加入0.40g α－淀粉酶，60℃水浴酶解4h，迅速升溫至100℃保持5min滅酶，3000r/min離心30min分離沉淀，上清液中加入4倍體積的95%乙醇，4℃沉淀12h，3000r/min離心10min，傾去上清，得棕黃色粗多糖沉淀。

采用中性蛋白酶與Sevage法聯合除蛋白，沉淀超純水溶解，加入中性蛋白酶(0.5U/mg粗多糖)，調pH為7，40℃水浴1h，再加入清液1/4體積的Sevage試劑(氯仿∶正丁醇 =4∶1)，振蕩后靜置 30min，3000r/min離心20min，上清液重復以上步驟6～8次，直至不再出現沉淀，清液減壓蒸餾，再醇析一次，得到瑪咖多糖沉淀，用無水乙醇反復洗滌2～3次，真空干燥后備用。

1.2.3 標準曲線的繪制 配制濃度為0.1mg/mL的葡萄糖標準溶液。取7支試管，編號，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL 葡萄糖標準溶液，補加超純水至2.0mL，各加入5%苯酚溶液1.0mL和濃硫酸5.0mL，搖勻15min顯色，于490nm處測量吸光值，以葡萄糖濃度C(mg/mL)為橫坐標，吸光值A為縱坐標，繪制標準曲線。回歸方程為:A=15.45C－0.02136(R2=0.9967)。

1.2.4 總糖的測定 將1.2.1中制備的瑪咖提取液用超純水稀釋適當的倍數，吸取1.0mL樣品溶液，補加超純水至2.0mL，按1.2.3的步驟測定吸光值，再由標準曲線計算不同溶劑浸提液中瑪咖總糖的提取率，見式(1)。

式中:C:瑪咖提取液中葡萄糖濃度(mg/mL);V:提取液總體積(mL);W:瑪咖干粉質量(mg)。

1.2.5 瑪咖多糖的測定 稱取干燥恒重的瑪咖多糖50.00mg，置于50mL容量瓶中，加超純水定容。再分別吸取此溶液 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0mL，置于試管中，補加超純水至10mL，按1.2.3測定吸光值，按照式(2)計算換算因子f。

式中:W:瑪咖多糖的質量(mg);C:瑪咖多糖溶液中葡萄糖濃度(mg/mL);D:稀釋因子(mL)。

經測定，f=2.227。

取1.2.1處待測溶液1.0mL于試管中，按1.2.3步驟測定吸光值，根據標準曲線與換算因子計算瑪咖粉中多糖提取率，見式(3)。

式中:C:瑪咖多糖溶液中葡萄糖濃度(mg/mL);D:稀釋因子(mL);f:換算因子;W:瑪咖干粉質量(mg)。

1.2.6 瑪咖多糖提取單因素優化 分別稱取瑪咖粉1.00g，置于磨口錐形瓶中，加入一定體積超純水，水浴加熱浸提一定時間，提取液減壓過濾，殘渣重復浸提步驟;合并濾液，減壓蒸餾濃縮，加入α－淀粉酶除去淀粉，醇沉，得棕黃色沉淀，超純水定容，測定瑪咖多糖含量并計算提取率。

前期研究顯示提取溫度、提取時間、料液比對多糖提取率影響較大，因此分別以這3個因素為對象，考察其對瑪咖多糖提取率的影響。

1.2.7 瑪咖多糖提取的正交實驗 在單因素優化結果的基礎上，以提取溫度、提取時間、料液比為影響因素，各取3個水平，采用L9(34)正交表進行正交實驗設計，以瑪咖多糖的提取率為指標，確定瑪咖多糖的最適提取工藝。因素水平表如表1所示。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels for L9(34)orthogonal experiment design

2 結果與討論

2.1 提取溶劑選擇

不同溶劑提取瑪咖總糖和多糖的結果如表2所示。溶劑對多糖提取率影響較大。未優化的條件下，水浸提液中瑪咖多糖提取率為2.44%，均高于甲醇、乙醇浸提液中多糖提取率。原因在于多糖具有良好的水溶性，疏水溶劑不利于多糖的提取，正己烷提取液中幾乎檢測不到多糖。溶劑對總糖提取率影響結果類似。水浸提液中瑪咖總糖提取率高達38.16%，高于甲醇、乙醇浸提液中總糖提取率。因此，以下實驗采用水為溶劑提取瑪咖多糖。

表2 不同溶劑提取多糖、總糖的結果Table 2 Extraction of maca saccharides with different solvents

2.2 單因素優化

2.2.1 提取溫度對瑪咖多糖提取率的影響 提取溫度對瑪咖多糖提取率的影響如圖1所示。隨著溫度的升高，瑪咖多糖提取率增加。60℃時多糖提取率只有2.37%，升溫到80℃時提取率僅增加到2.77%，90℃時提取率可達11.6%，提取溫度在100℃時提取率最高，為12.8%。因此瑪咖多糖提取溫度應控制在90～100℃之間。

圖1 提取溫度對瑪咖多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the polysaccharide yield

2.2.2 提取時間對瑪咖多糖提取率的影響 提取時間對瑪咖多糖提取率的影響如圖2所示。隨著提取時間的增加，多糖提取率逐漸增加，30min時提取率只有3.8%，60min時提取率可達8.04%，隨后繼續增加時間多糖提取率增加趨勢變緩，150min時多糖提取率為8.88%。考慮到增加提取時間會增加成本及能耗，瑪咖多糖最適提取時間應選擇在60～120min之間。

圖2 提取時間對瑪咖多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the polysaccharide yield

2.2.3 提取料液比對瑪咖多糖提取率的影響 料液比對瑪咖多糖提取率的影響如圖3所示。多糖提取率隨著液體比例的增加先增大后減小，在料液比為1∶20時，瑪咖多糖提取率最高，為11.9%。提取溶劑過少，提取不充分導致多糖提取率較低;但溶劑過多使樣品濃度降低不利于多糖提取，并且過多的溶劑會帶來后續溶劑回收成本過高的問題。因此瑪咖多糖最佳提取料液比應控制在1∶20左右。

2.3 正交實驗

根據單因素實驗結果，以提取溫度、提取時間、料液比為考察因素，設計3因素3水平正交實驗表(表1)，對瑪咖多糖提取工藝進行優化，結果見表3。

由表3極差分析結果可知，各因素對瑪咖多糖提取率的影響順序依次為:提取溫度(A)＞提取時間(C)＞料液比(B)。最佳提取條件為A3B1C3，即溫度100℃，料液比 1∶20(g∶mL)，提取 120min。在此條件下，瑪咖多糖提取率為15.9%。陳燕青等［11］研究中優化后水提瑪咖多糖提取率為12.53%，略低于本實驗優化結果，但其未說明瑪咖來源。浦躍武等［12］用超聲波提取，采用秘魯瑪咖粉末，瑪咖多糖的提取率為74.4%，其提取率可能是相對于瑪咖粉末中多糖含量計算的百分比，而本研究的計算依據是相對于瑪咖粉的質量。

圖3 提取料液比對瑪咖多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction solid－liquid ratio on the polysaccharide yield

表3 瑪咖多糖提取正交實驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment for polysaccharide extraction from maca

3 結論

通過對不同溶劑從云南種植瑪咖中多糖提取效果的比較發現，以水為溶劑提取率較高。其原因主要在于多糖在水中具有良好的溶解性。正交實驗結果顯示，各因素對瑪咖多糖提取率影響順序依次為:提取溫度＞提取時間＞料液比。最優提取工藝條件為:溫度 100℃，料液比 1∶20(g∶mL)，提取 120min。在此條件下，瑪咖多糖提取率為15.9%。多糖是瑪咖的重要生理活性物質之一，其提取純化工藝研究為瑪咖的功效物質開發奠定了基礎。

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