鮮切青椒優勢腐敗菌的分離純化及鑒定

包英才，王 丹，趙曉燕，馬 越，張 超，文連奎

(1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118;2.北京市農林科學院蔬菜研究中心，農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，農業部都市農業(北方)重點實驗室，北京100097)

青椒為我國夏秋季節的主要蔬菜之一，鮮切青椒是指新鮮青椒經分級、清洗、切分、包裝后，供消費者立即食用或者快餐行業配菜即用的新型蔬菜加工產品［1－2］，具有營養、衛生、美觀、便捷等特點［3］。鮮切青椒由于鮮切造成組織結構損傷，原有的保護系統被破壞、汁液外溢。高濕度、較大的鮮切面積及豐富的營養為微生物提供了有利的生長條件，是微生物生長的良好培養基。因此，微生物污染與繁殖在很大程度上導致了鮮切青椒的品質下降［4］，致腐微生物是導致鮮切青椒腐敗變質的主要原因［5］。然而，不同蔬菜上的微生物群落差別很大，新鮮葉菜類蔬菜上的主要微生物是假單孢菌屬和歐文氏菌屬，新鮮番茄上主要為黃桿菌屬和假單孢菌屬，這些細菌不僅能分解果膠，而且在低溫下仍能繁殖存活，致使蔬菜組織腐?。?－7］。目前國內外關于鮮切蔬菜的研究主要涉及:切割果蔬的褐變與護色、貯藏溫度、包裝方式、不同切割大小和方式、可食性膜的選擇以及微生物的控制等幾個方面［8］，對于特定腐敗微生物的研究較少，尤其是關于鮮切青椒優勢腐敗菌未有報道。而篩選、鑒定優勢腐敗菌，研究其特性，能夠為進一步有針對性的殺菌處理提供理論基礎和技術借鑒，并對其加工過程進行有效控制提供參考［9］。因此，本實驗以目前市場上主要的青椒品種為試材，進行鮮切工藝處理，分離篩選出鮮切青椒的優勢腐敗菌，對其腐敗能力進行了驗證，并通過生理生化檢測對菌株特性做出初步的鑒定。為揭示此優勢腐敗菌的特性及針對性的殺菌處理提供研究基礎，對維持鮮切青椒的產品品質、延長貨架期方面具有重要意義［10］。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

“京甜3號”、“中椒7號”、“冠軍椒王”、“強舟”四個品種青椒 由北京市小湯山實驗基地提供，采后選取大小、重量均一的青椒運輸2h后立即貯藏于10℃恒溫恒濕箱內預冷;蛋白胨、牛肉膏、營養瓊脂培養基 由北京奧博星生物技術有限責任公司提供;氯化鈉、氫氧化鈉、次氯酸鈉 由北京化工廠提供;AIP 20E、API 50CH試劑盒 均委托北京寶杰羅生物公司購買。

ZEALWAY滅菌鍋 美國致微公司;HDL APPARATUS超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;INCUCELL培養箱 德國MMM公司;UV－1800型紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮮切青椒腐敗率的測定 腐爛率(%):將100g青椒切成大小均一的小塊兒放入盒子里，每隔1d計數發霉、腐爛的產品，以表面有腐爛的切塊占總切片的百分數表示，重復3次取平均值。

1.2.2 鮮切青椒中優勢菌株的分離純化 采用平板計數法在營養瓊脂培養基上，37℃培養24～48h;從10－8、10－9挑取占優勢且形態不同的單菌落進一步劃線分離，進行培養。將上述培養基中長出的菌株在營養瓊脂培養基上劃線培養，等出現單個菌落時轉接到新營養瓊脂培養基中繼續培養，重復上述操作即可得到純化菌種。菌種編號后轉接到試管斜面4℃冰箱保存備用。初步觀察其菌落形態和大小、邊緣、表面、隆起形狀、顏色及透明度等［11］。

1.2.3 鮮切青椒優勢菌株反證實驗 選取1.2.1中得出的最易腐敗的品種鮮切青椒和健康的整塊青椒，先用純水清洗，再用200ppm濃度次氯酸鈉水沖洗。浸泡于制備好的不同濃度的菌懸液中，分別進行“有傷”和“無傷”接菌。在10和25℃下貯藏。逐日觀察并記錄果實和果塊的腐敗情況，從而判斷所接菌種是否為優勢腐敗菌。

1.2.4 細菌鑒定 革蘭氏染色;API20E試條:根據API20E試條操作指南進行生化鑒定;API50CH試條:根據API50CH試條操作指南進行生化鑒定;

1.3 數據處理

圖像繪制采用Origin 8.1軟件(美國Origin Lab Corporation公司)，并對數據顯著性分析，置信區間為95%。

2 結果與分析

2.1 鮮切青椒腐爛率的變化

青椒在貯藏期間因微生物污染因素而腐敗，本實驗對不同品種青椒在貯藏期腐爛程度進行研究，分別在10、25℃條件下貯藏，觀察不同天數后的腐爛率。結果見圖1、圖2。

圖1 不同品種鮮切青椒10℃貯藏期間腐爛率的變化Fig.1 Changes of corruption rate in different varieties of fresh cut green peppers at 10℃during storage

圖1結果可知供試品種鮮切青椒果實隨著貯藏時間的延長，腐爛率有明顯上升趨勢。與未貯藏相比，鮮切“冠軍椒王”、“強舟”在第4d、“中椒7號”在第3d出現腐爛，8d完全腐爛;“京甜3號”第3d開始有腐爛第7d完全腐爛。由此可見，鮮切“京甜3號”腐爛程度最嚴重，因此以第7d各品種鮮切“京甜3號”青椒腐敗組織為研究對象，篩選優勢菌株。

圖2 不同品種鮮切青椒25℃貯藏期間腐爛率的變化Fig.2 Changes of corruption rate in different varieties of fresh cut green peppers at 25℃during storage

圖2結果可知25℃貯藏條件下，所有供試品種鮮切產品較10℃貯藏條件下腐敗快，第1d均開始有明顯腐爛?！熬┨?號”第3d腐敗率已經達到了90%，而其它品種鮮切青椒腐敗率也在貯藏的第4d達到了100%。由此可見，鮮切“京甜3號”腐爛程度最嚴重、腐爛速度最快、最不易儲藏，因此以第3d腐敗組織為研究對象，篩選優勢菌株。

2.2 鮮切青椒中優勢菌株的分離純化

供試品種青椒，平板計數法篩選優勢菌，10倍梯度稀釋8次后仍有很多種菌株，其中有兩個菌株的量最大，以菌株A和菌株B表示。采用平板劃線法進一步分離純化A和B兩個優勢菌，在營養瓊脂培養基上的形態觀察結果見表1。

2.3 菌種返接鮮切青椒的腐敗性觀察及主要腐敗菌的鑒定

生長優勢菌不一定為主要腐敗菌，進一步通過反接驗證其腐敗性，最終鑒定A、B是否為優勢腐敗菌。結果見表2。

表1 腐敗鮮切青椒中菌落形態鑒定結果Table 1 Colony morphology identification results in the corruption of fresh－cut green pepper

表2 鮮切青椒接種的腐敗情況Table 2 The decayed situation of fresh－cut green pepper after artificial inoculation

表3 菌株B的生理生化特性Table 3 The physiological and biochemical character of Strain B

由表2可知25℃儲藏3d，10℃貯藏5d，無論接種高濃度還是低濃度A菌株的鮮切青椒均沒有發生腐爛，而接種高濃度和低濃度B菌株的青椒均產生了明顯的腐敗現象?？梢钥闯?，菌株A沒有致腐性，不是鮮切青椒腐敗菌;B具有明顯致腐性，為鮮切青椒優勢腐敗菌。

2.4 優勢腐敗菌初步鑒定

由2.3得知菌株B為主要腐敗菌，經過顯微鏡觀察及革蘭氏染色結果得知菌株B為陰性桿狀細菌，生理生化性質測定結果見表3。

結合API20E試條和API50CH試條說明書判定，菌株B為歐文氏菌，這與韓巍巍等［1］的報道結果相似:蔬菜組織中含酸量低，易遭受土壤細菌侵染，如歐文氏菌、假單孢菌、黃單孢菌等，致使蔬菜組織腐敗。而鮮切青椒中的優勢腐敗菌屬于歐文氏菌屬中哪一個種需要進一步鑒定。

3 結論

3.1 通過對鮮切“京甜3號”、“中椒7號”、“冠軍椒王”、“強舟”四個品種青椒的腐敗組織中優勢菌株的分離篩選，得到A、B兩個優勢菌株。

3.2 微生物反接實驗結果表明菌株A對鮮切青椒沒有致腐能力，B使鮮切青椒組織發生腐爛，是鮮切青椒的優勢腐敗菌。

3.3 經過菌落形態觀察、革蘭氏染色、生理生化鑒定結果可知菌株B為革蘭氏陰性桿狀菌株，歐文氏菌，具體種的鑒定有待進一步研究。

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