花青素分離純化及其組分鑒定研究進展

王秋霜，凌彩金，劉淑媚，趙超藝，李家賢

(廣東省農業科學院茶葉研究所，廣東省茶樹資源創新利用重點實驗室，廣東廣州510640)

花青素(anthocyanidin)又叫花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性色素，屬類黃酮化合物，是構成花瓣和果實顏色的主要色素之一。花青素不僅使花卉、水果和蔬菜呈現美麗的顏色，還賦予更高的功能性。花青素具有延緩衰老、抗氧化［1－4］、抗突變［5］、抑制腫瘤細胞發生［6］、預防心腦血管疾病、保護肝臟、降低 DNA 氧化損害［7］、降血糖［8］等多種生理功能。天然色素與合成色素相比安全性高，且具有一定的營養和藥理作用［9］。因此，開發利用天然色素資源日益受到人們的重視。提取、分離、純化是功能性物質研究的第一步，因此本文將對該領域的研究進展進行綜述。

1 花青素的基本概況

花青素存在于很多植物中，如紅葡萄、草莓、藍莓、茄子、紫薯等等。花青素大部分都是水溶性色素，是果實、植株、花呈現出紅、橙、紫、藍等顏色的重要原因［10］。花青素屬類黃酮化合物，基本結構單元為α－苯基苯并吡喃型陽離子(圖1)，因3’及5’位置的取代基不同(羥基或甲氧基)，形成了各種各樣的花青素［11］。現已知的花青素有20多種，主要存在于植物中的有6種:天竺葵素(pelargonidin)、矢車菊素或芙蓉花色素(cyanidin)、翠雀素或飛燕草色素(delphindin)、芍 藥 素 (peonidin)、錦 葵 色 素(Malvidin)及牽牛花色素(Petunidin)等［12］。有研究認為，在發酵和未發酵茶葉中已經鑒定的花青素主要是前五種，其中最主要的是錦葵色素［10］。楊賢強等［13］發現，茶葉中花青素主要有四種，除了上述的前3種外還包括翹搖紫苷元(三策啶)。

此外，茶葉中還存在原花色素(proanthocyanidins)，由花白素和兒茶素聚合而成，酸性條件下兩類物質可部分轉化為花青素［11］。自然條件下，游離的花青素主要以糖苷形式存在，花青素與葡萄糖鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通過糖苷鍵形成花色苷，已知天然的花色苷有250多種［11］。

花青素可以隨著細胞液的酸堿度而改變顏色:細胞液呈酸性則偏紅，細胞液呈堿性則偏藍。因為茶葉細胞顯酸性，因此葉片顯現紅色。花青素在普通的綠色芽葉中僅含0.1%，紅紫色芽葉中含量高達1%以上［14］。低溫時，有些植物的莖葉會變成紫紅色，這是因為葉片里的碳水化合物轉變成花青素的緣故，秋天的紅葉也是葉片的花青素引起的。光可增加花青素含量，高溫會使花青素降解。

2 花青素分離純化方法研究進展

從植物中分離、純化得到花青素類物質并應用于食品、醫藥等領域已經成為花青素研究的新熱點。

圖1 花青素基本結構Fig.1 Basic structure of anthocyanidin

由于花青素分子具有酸性與堿性基團，因此較易溶于水、酸堿及有機醇溶劑中［11］。因此，花青素一般可以用極性溶劑來提取。傳統的提取方法是在低沸點的醇類中添加鹽酸，如使用酸性乙醇［15－19］;也有不加酸，僅僅用乙醇來提取［20－21］。但是，有學者研究認為添加鹽酸可能引起花青素的分解［22］。因此，現在有學者提倡使用丙酮添加弱有機酸，但丙酮有一定的毒性，因此應用并不廣泛［23］。花青素在較強的酸性條件下相對穩定，在提取液中有必要添加酸來維持其穩定性。但是，添加酸的種類不同對花青素本身會產生影響，強酸可能引起糖苷鍵的斷裂，影響結果的準確性［24］。

提取的方法主要包括超聲波輔助萃取［25］、微波萃取［16，18，20］、水浴加熱萃取等。提取條件的研究較多，包括酸的濃度(pH)、醇濃度、浸提時間、浸提溫度、料液比、提取次數等;在單因素實驗基礎上通過正交或者二次旋轉回歸方法對提取因素進行優化。

Kerio［10］等研究人員采用甲醇－鹽酸提取茶葉中的花青素。茶樹中有一類特殊的資源，即新生的芽葉呈現出紅紫色，主要是內含花青素的原因。常溫下提取4h，然后濃縮、凍干，通過SPE固相萃取柱進行純化，然后進入液相色譜儀分析。國內有學者用乙醇水溶液粗提得到茶葉花青素的水溶液，用石油醚脫脂后用三氯乙烷萃取，得到氯仿層溶液和水層;水層用乙酸乙酯萃取得到花青素水溶液，濃縮后干燥得到粗提物。接著采用硅膠柱層析分離，用不同的溶劑進行梯度洗脫，將斑點相似或相同的洗脫液合并，濃縮干燥，采用紫外－可見光譜掃描并進行初步鑒定，在465～550nm有吸收峰，可以確定含有花青素。羅正飛等［26］采用乙醇溶劑提取紫鵑茶中的花青素物質，研究了最佳提取工藝:70%乙醇溶劑、回流30min、回流溫度 80℃，料液比 1∶10［12］，本文采用文獻［27］的方法測定了花青素含量。

黑布林是花青素提取的一種材料來源。有學者采用正交實驗對黑布林皮中的花青素提取工藝進行優化，確定了適宜的提取工藝條件為75%乙醇溶液、pH為2.5、浸提溫度50℃、浸提時間60min、料液比1∶5可得花青素最大提取率為0.539%。此外，還發現黑布林皮花青素可與常用的食品基質配伍，對熱、酸及常見的金屬離子都有較好的穩定性。花青素總量采用pH示差法測定［15］。

對藍莓類材料中花青素提取的研究較多。有學者［19］采用乙醇浸提法提取藍莓果中的花青素。研究認為最佳提取條件為 pH3.5、浸提溫度50℃、浸提60min、乙醇濃度50%，提取1次的提取率最高。還有研究人員比較了四種提取液對草莓和藍莓花青素提取的效果，發現甲醇—水—乙酸提取量最好，建議采用 HPLC 法對花 青 素進 行 定 量［24］。Dai［28］采 用0.01%HCl/乙醇超聲處理黑莓湯，凍干后得到花青素提取物。篩選了不同酸性乙醇的濃度，分別為100%、90%、75%、50%、25%、10%。發現濃度為50%時的總提取含量最多。花青素的總量測定采用pH示差法;單體測定采用HPLC方法、在524nm下檢測主要花青素種類。

糧食作物中紫甘薯和紫玉米研究的較多。姚鈺蓉［29］的研究表明，通過單因素和正交實驗得到紫甘薯花青素最佳提取條件:甲酸濃度5%，提取溫度60℃，提取時間1h，料液比1∶10，提取3次。對紫玉米花青素提取的研究發現，以蒸餾水、酸性水溶液(pH3)和酸性醇為提取劑時，酸性醇的提取率明顯高于其他方法［30］。

還有對一些紫紅色花中花青素提取的研究，如李升鋒［31］運用四因素二次回歸正交旋轉組合設計實驗方案，研究了溫度、時間、液料比、乙醇濃度對玫瑰茄干花萼花青素提取率的影響，確定了花青素提取的較好條件。國外的Ben Amor［32］利用熱化學快速降壓(DIC)使洛神葵花萼組織破碎，研究了各種操作參數，認為DIC處理可以改善洛神葵花萼花青素的動力學和提取的產率。

3 花青素分析方法及組成鑒定方法

花青素的測定方法包括用單一pH法和pH示差法;組成及組分含量鑒定采用色譜法。

單一pH法:采用水溶液浸提茶湯，用酸性乙醇顯色，在535nm測定花色苷含量，一般用平均比消光度(101.83)來測定花色苷總量［27］。

pH示差法:在兩個不同的pH下，花青素溶液的吸光值的差值與花青素的含量成比例。即在520和700nm下測定pH1.0和pH4.5處理液吸光度值的差異。國內外很多研究采用這種方法測定，認為該法能很好地消除溶液中雜質對測定結果的影響［10］。

陳瓊等［33］采用上述兩種方法比較測定了茶樹芽葉花色苷含量，結果表明:單一pH法測定值高于pH示差法，兩者線性關系良好;pH示差法能較好地消除干擾物質對測定結果的影響，為茶葉的花色苷定量分析提供了依據。

色譜法是樣品組分分離鑒定的重要分離手段，并在多種物質的鑒定方面已經大規模應用。Kerio等［10］采用 SPE方法純化 kenya茶花青素后，利用HPLC－UV－Vis在520nm測定了花青素組分，在發酵和未發酵茶葉中鑒定出天竺葵素、矢車菊素、飛燕草色素、芍藥素和錦葵色素。其中最主要的是錦葵色素。

Nafiz Oncu Can［34］等采用梯度洗脫利用 HPLCDAD在18min內對28種水果和蔬菜中的花青素進行了分離和鑒定，鑒定了6種食物中最多的花青素物質，如三種葡萄糖苷的天竺葵色素、花青素、芍藥素、花翠素、牽牛花色素、錦葵色素苷元。

反向逆流色譜(CCC)已經成功地應用到分離和純化花青素物質，CCC分離所用的溶劑是極性的，因為含有n－丁醇，所以在濃縮和揮發時比較難把握。通常會使用三氟乙酸(TFA)防止花青素平衡向陽離子方向轉化，也會改善分離效果［35］。紫露草葉、紫棉、接骨木果汁、紅酒、黑莓中花青素也開展了CCC高速逆流色譜的分析，HPLC－ESI－MS得到了純的花青素［36］。Cato Fr?ytlo［37］利用 Toyopearl HW－40F gel和反相液相色譜法可以分離黑醋栗的花青素，而不需要使飛燕草素－3－O－葡萄糖苷和花青素－3－O－蕓香糖苷及小的芍藥素和錦葵色素－3－O－蕓香糖條帶重疊。

國內學者利用高效液相色譜－電噴霧離子化串聯質譜聯用技術(HPLC－ESI－MS/MS)對藍莓提取物中的花青素和黃酮醇進行了分析，結構上的不同導致花青素和黃酮醇在紫外－可見光譜吸收、離子化以及裂解方式上都存在差異［38］。花青素在530nm附近有特征吸收，負離子模式下黃酮醇可以生成負離子和自由基負離子，而正離子型的花青素則幾乎不產生質譜信號，這一顯著差異可以區別花青素和黃酮醇。研究中鑒定了飛燕草定－3－O－葡萄糖苷，錦葵定－3－O－葡萄糖苷和槲皮素［38］。

4 結論和展望

4.1 花青素物質的分離一般采用酸性醇溶液，利用超聲波輔助萃取、微波萃取、加熱萃取等方法進行。提取條件包括酸的濃度(pH)、醇濃度、浸提時間、浸提溫度、料液比、提取次數等;在單因素實驗基礎上通過正交或者二次旋轉回歸方法對提取因素進行優化。總量測定方法為單一pH法和pH示差法;組分測定采用HPLC方法。

4.2 花青素使花瓣和果實呈現出亮麗的顏色，還具有延緩衰老、抗腫瘤細胞發生、預防心腦血管疾病、降血糖等多種生理功能。開發天然色素具有較高的使用安全性和功能性，因此相信隨著社會的不斷進步、科技的日益創新，在天然色素的開發領域花青素資源具有更加廣泛的發展空間和前景。

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