羧甲基殼聚糖包覆薏苡仁油脂質體包覆率測定方法的研究

白春清，熊 華，羅國偉，史 卿，鐘紅蘭，阮 霞，趙士強，趙 強

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047）

薏苡仁為禾本科（Gramineae）薏苡屬（Coix L.）草本植物薏苡（Coix lachryma-jobi Linn）的成熟種仁[1]。作為藥食同源性食物，薏苡仁在亞洲地區有上千年的食用及藥用歷史，其營養豐富且具有健脾、補肺、清熱、利濕等功效，《本草綱目》中稱其乃上品養心藥[2]。薏苡仁油為薏苡仁中提取的脂溶性物質，其含量約為薏苡仁的2%～7%，國內外研究證實薏苡仁油具有增強免疫力、抗腫瘤、降血脂等功能[3－6]。但薏苡仁油口服吸收生物利用率低，且易氧化分解，限制了其在食品及醫藥工業中的應用和發展[2]。脂質體是一種新型的納米膠囊制備技術，多用于藥物和功能性成分的載體，其脂質雙分子結構可將脂溶性成分載入，改善油溶性物質的親水性及其在胃腸道中的生物利用率[7－8]。但常規脂質體易出現穩定性差，聚集、分層現象，長期存放易引起藥物滲漏等問題[7]。若以水溶性聚合物對常規脂質體進行包覆，可在其表面形成保護膜，減少脂質體與周圍環境的交互作用，提高常規脂質體及薏苡仁油的穩定性[9]。羧甲基殼聚糖是殼聚糖經羧甲基化而制得的水溶性多糖，其良好的生物相容性、可降解性、無免疫原性及無毒等優點，使其成為包覆薏苡仁油脂質體的首選水溶性聚合物[10－11]。羧甲基殼聚糖對常規脂質體的包覆效果將直接影響脂質體的穩定性。但是目前國內關于羧甲基殼聚糖包覆脂質體的文獻報道較少[12－13]，而現有文獻中對包覆率這一重要指標又無從考查，這對制備高質量的聚合物包覆脂質體來說無疑是一個缺陷。本實驗在查閱眾多文獻的基礎上得知硫氰鐵銨分光光度法是測定磷脂含量比較準確簡單的方法，采用該方法測定未包覆脂質體中磷脂含量及總磷脂含量，即可在側面定量測定包覆率。為了得到未包覆脂質體及準確定量出脂質體中的磷脂，本文擬采用離心法將未包覆脂質體與包覆脂質體分離，用乙醇－超聲法對未包覆脂質體破壁令脂質體中的磷脂充分釋放并經氯仿提取后，通過硫氰鐵銨法測定的磷脂含量，再根據總磷脂的含量計算包覆率，為更好地評價聚合物包覆脂質體包覆效果提供簡捷準確的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

蛋黃卵磷脂 沈陽仙峰科技發展有限公司；膽固醇 上海藍季科技發展有限公司；薏苡仁油 廣州合誠三仙生物科技有限公司；羧甲基殼聚糖 上海晶純試劑有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、氯仿 國藥集團化學試劑有限公司；硫氰酸銨 浙江溫州化學用料廠。

THZ－82恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；超聲波發生器 上海科導超聲儀器有限公司；RE－52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化科技儀器廠；SHB－3循環水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；TDL－5－A臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；BS224S分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 包覆脂質體的制備[14]按照磷脂∶膽固醇=3∶1稱取膜材及適量薏苡仁油，向其中加入適量的乙醇溶解，用蠕動泵將其注入到pH6.8的磷酸緩沖液中，于45℃振蕩水化20min后，旋轉蒸發除去乙醇，超聲處理30min得常規脂質體懸液，將其注入到羧甲基殼聚糖溶液中，磁力攪拌60min后，間歇超聲處理8min得羧甲基殼聚糖包覆脂質體。

1.2.2 測定波長的確立 根據硫氰鐵銨不溶于氯仿，但其與磷脂反應生成的紅色絡合物能溶于氯仿，且在某個波長處有最大吸收，而磷脂與薏苡仁油等在此處無吸收或吸收很小，通過測定該絡合物的吸光度即可測定脂質體中磷脂的含量[14－15]。對于脂質體而言磷脂是構成其囊壁的主要成分，本實驗采用乙醇破壁法將脂質體的囊壁破壞，充分釋放出所有磷脂，然后采用硫氰酸銨法測定磷脂的含量。

溶液的配制：參照林筱琦等[15]的方法分別配制濃度皆為1mg/mL的磷脂、薏苡仁油溶液。按照1.2.1分別制備未包覆的空白脂質體及薏苡仁油脂質體。

測定波長的確立：精密吸取1mg/mL蛋黃磷脂溶液0.6mL置于試管中，加硫氰鐵銨溶液8.0mL，再補加氯仿，使試管中氯仿的最終體積為8.0mL。將上述溶液轉移至25mL的分液漏斗中，充分振搖，靜置，取下層，以氯仿為空白，在紫外可見分光光度計上于300～600nm范圍內掃描，分別取相同體積的薏苡仁油，用乙醇－超聲破壁的未包覆空白脂質體及薏苡仁油脂質體，采用同樣的方法處理并進行掃描。

1.2.3 處理條件的確定 影響測定吸光度的關鍵因素包括包覆脂質體與未包覆脂質體是否完全分離、脂質體的壁是否完全打開等。本實驗以吸光度為指標，確定離心條件及破壁條件。

破壁條件確定：結合文獻資料[16]及預實驗選擇乙醇－超聲法對常規脂質體進行破壁，并對乙醇用量及超聲時間對吸光度的影響進行考察，確定破壁條件。

離心條件的確定：包覆脂質體與常規未包覆脂質體，能否完全分離，是影響準確測定的先決條件，以離心速度和離心時間對吸光度的影響進行了考察。

1.2.4 標準曲線繪制 精密吸取1mg/mL的磷脂溶液0.08、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80mL置于試管中，其余按照1.2.2的方法操作，以氯仿為空白，在1.2.2所確定的測定波長處測定吸光度A，以A對濃度C（mg/mL）進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.2.5 回收率實驗[16]精確稱取磷脂1mg/mL，按配方[14]加入膽固醇、薏苡仁油、羧甲基殼聚糖適量，制備包覆脂質體。精密吸取包覆脂質體混懸液0.6mL，按1.2.3項下確定的條件進行離心分離及破壁處理后按照1.2.2的操作測定未包覆脂質體中磷脂的含量。另精確稱取磷脂1mg/mL，用氯仿溶解之后按1.2.2操作。根據標準曲線方程計算磷脂含量及方法回收率。

1.2.6 精密度及重現性實驗 按照1.2.5的方法制備包覆脂質體混懸液及磷脂溶液，分別于同日不同時間及不同日精密吸取包覆脂質體混懸液及磷脂溶液適量，按1.2.3項下條件打開未包覆包覆脂質體，以下操作同1.2.2。并按標準曲線計算磷脂含量，測定方法的精密度和重現性。

1.2.7 數據的統計處理 實驗數據采用SPSS 12.0軟件進行統計分析，數值以3次實驗的均值表示，選取a=0.05進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 最大吸收波長的確定

從圖1中得知，磷脂與硫氰鐵銨產生的絡合物在470nm處有最大吸收（圖1－a），而薏苡仁油脂質體、空白脂質體和磷脂溶液峰形一致（圖1－b、c），薏苡仁油在470nm處吸收為負值，說明樣品中的薏苡仁油對磷脂含量測定基本無干擾，故選擇470nm為測定波長。

圖1 磷脂紫外可見吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of phospholipid

2.2 破壁條件的確定

根據表1可知，隨著乙醇用量的增加，吸光度逐漸增大，脂質體破壁越來越嚴重；當乙醇用量為0.8mL時，吸光度基本穩定，繼續增大乙醇用量，對吸光度幾乎沒影響，說明乙醇用量為0.8mL時能充分打開脂質體，從而釋放出所有磷脂。固定乙醇用量為0.8mL，考察破壁時間對吸光度的影響，發現當超聲時間為15min時，吸光度基本穩定，且繼續延長破壁時間，吸光度變化不顯著（p＞0.05），證明此時樣品破壁完全（表2）。上述結果確定薏苡仁油脂質體的最佳破壁條件為乙醇用量0.80mL，超聲時間15min。

表1 乙醇用量對吸光度的影響Table 1 The effect of ethanol volume on absorbance

表2 超聲時間對吸光度的影響Table 2 The effect of ultrasonic time on absorbance

2.3 離心條件的確定

2.3.1 離心速度[16]的確定 分別采用不同的離心速度3000、5000、10000、15000、20000r/min離心10min，然后精確取上層液適量，按照2.2破壁條件破壁，按照1.2.2的方法處理后于470nm波長處測定吸光度，考察離心速度對吸光度的影響。如圖2所示，隨著離心速度的升高，未包覆脂質體測定的吸光度值逐漸降低，脂質體分層逐漸明顯，

圖2 離心速度對吸光度的影響Fig.2 Effect of centrifuging speed on absorbance

由于包覆脂質體的重量高于常規未包覆脂質體，隨著離心速度的提高，越來越多的包覆脂質體沉于下層，而未包覆脂質體置上層，即未包覆脂質體測定的吸光度值逐漸降低；當離心速度為10000r/min離心時，樣品的吸光度達到最小值，包覆脂質體能出現明顯的分層；之后隨著離心速度的升高吸光度逐漸升高，可能是由于離心速度過大，所被包覆的脂質體從羧甲基殼聚糖層中溢出變成未包覆脂質體所致。

圖3 離心時間對吸光度的影響Fig.3 The effect of centrifuging time on absorbance

2.3.2 離心時間的確定 按照確定10000r/min離心速度分別離心5、10、15、20、25min，然后精確取上層液適量，經破壁，測定吸光度，考察離心時間對吸光度的影響，結果如圖3所示。

同樣離心時間不足時，吸光度偏大，由上層液中殘留包覆脂質體所致；當離心時間過長時，結果偏大，源于包覆脂質體從包覆層中滲漏，綜上選取離心時間為15min。

2.4 包覆率的測定

將一系列濃度的薏苡仁油溶液在470nm處測定吸光度A后，以A對濃度C（mg/mL）進行線性回歸（如圖4所示），得標準曲線方程：A=10.963C+0.0156，相關系數R2=0.9991，在0.01～0.1mg/mL的濃度范圍內，線性關系良好。包覆率計算公式為：

式中：C1—包覆脂質體離心后測得上清液中磷脂的濃度；C0—包覆脂質體未經離心直接測得磷脂的總濃度。

圖4 磷脂標準曲線Fig.4 The standard curve of phospholipid

2.5 回收率實驗

本實驗測定的回收率實驗結果如表3所示，磷脂及脂質體中平均回收率均高于99%，RSD＜2%，能滿足脂質體中磷脂測定的要求[15]。

表3 回收率實驗結果Table 3 Result of recovery

2.6 精密度及重現性實驗

表4 精密度及重現性實驗結果Table 4 Result of precision and reproducibility

精密度及重現性實驗結果如表4所示，磷脂溶液及脂質體的測定結果的日內、日間平均值均高于97%，RSD＜5%，說明該方法的精密度及重現性較好[16]。

3 結論

3.1 磷脂與硫氰酸銨產生的絡合物在470nm處有最大吸收，而薏苡仁油脂質體、空白脂質體和磷脂溶液峰形一致，薏苡仁油在470nm處吸收為負值，樣品中的薏苡仁油對磷脂含量測定基本無干擾，故選擇470nm為測定波長。磷脂標準曲線為A=10.963C+0.0156，相關系數R2=0.9991，在0.01～0.1mg/mL的濃度范圍內，線性關系良好。

3.2 采用離心的方法將包覆脂質體與未包覆脂質體分離，并結合乙醇－超聲法破壁未包覆脂質體，進而計算磷脂含量及包覆率，經回收率、精密度及重現性實驗，驗證該方法的可行性。實驗采用的離心分離速度為10000r/min，時間15min；破壁條件為超聲處理15min、乙醇用量0.8mL；該方法回收率高于99%，精密度及重現性高于97%。

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