不同碳源條件下產色素甲烷氧化細菌的菌株特性研究

張 帥，辛嘉英，2，*，姜加良

（1.哈爾濱商業大學食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076）

（2.中國科學院蘭州化學物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅蘭州730000）

甲烷氧化細菌（Methanotrophicbaeteria，Methanotrophs）是甲基氧化菌的一個分支，是一類能以甲烷作為唯一碳源和能源生長的微生物。它在自然界普遍存在，在全球甲烷的平衡中起重要作用，從而對調節全球氣候變暖發揮著不可忽視的作用[1]。甲烷氧化細菌，其獨特之處在于能利用甲烷作為唯一的碳源和能源。他們能氧化大部分厭氧環境中產生的甲烷，在不飽和土壤中氧化大量的大氣甲烷。幾乎所有的甲烷氧化菌都是專性甲烷氧化菌，革蘭氏陰性[2]。甲烷氧化菌的典型特征是含有甲烷單氧酶（MMO）[3]，MMO在分子氧的作用下將甲烷氧化為甲醇，甲醇在甲醇脫氫酶的作用下先氧化為甲醛，繼而在甲醛脫氫酶和甲酸脫氫酶的作用下將甲醛進一步氧化成CO2和H2O，從而為細胞代謝提供NADH[4]。甲烷氧化菌于1906年首次被荷蘭微生物學家Sohngen分離出來[5]。1970年Whittenbury等[6]分離和鑒定了100多種利用甲烷的細菌，為現代甲烷氧化菌的分類奠定了基礎。本文通過對實驗室分離出的甲烷氧化細菌M13在甲烷和甲醇不同碳源條件下的研究，了解該產色素細菌的菌種特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種甲烷氧化細菌M13 哈爾濱商業大學食品工程學院從野外土壤中分離出；甲烷、液體甲醇、NH4Cl、K2HPO4、KH2PO4·7H2O、KNO3、NaCl、Na2HPO4·12H2O、EDTA、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、FeCl3、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·H2O、瓊脂、CAS溶液、CuSO4溶液、HDTMA溶液、結晶紫、碘液、乙醇、沙黃、萘、萘酚、固藍B、磷酸緩沖溶液。

DMBA200LED-B數碼顯微鏡 北京麥克奧迪顯微鏡公司；UV-2550型紫外可見分光光度計 日本島津公司；HNY-100B型恒溫培養振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；DHP－9162型電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；LDZX－50KB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；DL－CJ－2ND1潔凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；BSA224S、BSA2202S電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甲烷氧化細菌M13培養基的配制 甲烷氧化細菌由于能利用甲烷或甲醇為碳源進行生長，因此在以甲烷或甲醇培養時，在其液體培養基配方中沒有出現有機碳源或無機碳源。碳源以氣體或液體形式單獨提供。由于目前甲烷氧化細菌M13自身沒有適合的培養基，所以本實驗采用現有的甲烷氧化細菌IMV3011的培養基對其進行培養，IMV3011的培養基配方如下所示：

A液（g/L）：NH4Cl（0.5），KH2PO4（0.4），K2HPO4（0.4），CaCl2·2H2O（0.02），MgSO4·7H2O（0.3），NaCl（0.3），KNO3（1.0），EDTA（0.01），Na2HPO4·12H2O（0.74），FeCl3（0.001），FeSO4·7H2O（0.004）；

B液（g/L）：MnSO4·5H2O（3×10－4），ZnSO4（3.4×10－4），NaMoO4·2H2O（2.4×10－4）。

1.2.2 甲烷氧化細菌M13的液態培養 先將配制好的培養基倒入250mL三角瓶中，放入高壓滅菌鍋中滅菌。滅菌完畢后，置于無菌操作臺上冷卻并接種，接種量為10%。

1.2.2.1 甲烷作為碳源 以甲烷為碳源培養，需采用抽真空法置換入新鮮的甲烷∶空氣（體積比1∶1）的混合氣，將接好種的三角瓶放入搖床中進行培養，培養條件為30℃，180r/min，每24h換一次氣，培養時間5、15d，觀察結果。

1.2.2.2 甲醇作為碳源 以甲醇為碳源培養，每24h加入甲醇一次，添加量為0.01%。培養時間5、15d，觀察結果。

1.2.3 甲烷氧化細菌M13的固態培養 向配制好的培養基中加入1.5%的瓊脂，滅菌完畢后，置于無菌操作臺上冷卻。并采用稀釋平板法以1/100和1/1000的菌種濃度進行涂布接種，接種量為10%。分別以甲烷和甲醇為碳源進行培養，30d后取出培養皿，觀察甲烷氧化細菌M13的生長及產色素情況。

1.2.4 甲烷氧化細菌M13細胞形態觀察 本實驗采用的是顯微鏡觀察。

將培養好的甲烷氧化細菌M13革蘭氏染色，并做成水封片，在顯微鏡40倍和油鏡下，對革蘭氏染色后的菌體細胞進行觀察。

1.2.5 不同碳源對甲烷氧化細菌M13生長情況的影響 按上述方法分別以甲烷和甲醇為唯一碳源對甲烷氧化細菌M13進行液態培養，培養條件為30℃，180r/min，利用紫外分光光度計測其600nm的OD值，每6h測一次，從而直接反映出M13菌種在兩種不同碳源下的生長情況，并對其生長曲線進行記錄與分析。

2 結果與分析

2.1 甲烷氧化細菌M13液態培養生長情況

取原菌種以10%接種量接種至液態培養基中，分別在甲烷和甲醇條件下培養5、15d后，觀察菌體形態及菌液變化，結果如圖1～圖4所示。

圖1 甲烷為碳源培養5d的菌種Fig.1 M13 with methane as the carbon source after 5 days

圖2 甲醇為碳源培養5d的菌種Fig.2 M13 with methanol as the carbon source after 5 days

圖3 甲烷為碳源培養15d的菌種Fig.3 M13 with methane as the carbon source after 15 days

圖4 甲醇為碳源培養15d的菌種Fig.4 M13 with methanol as the carbon source after 15 days

由圖1～圖4可知，當甲烷氧化細菌M13培養5d后，可以看到菌體已生長，菌液開始變得渾濁，瓶壁上附有菌膜，甚至可觀察到菌苔的形成，此時顏色變化不大；當甲烷氧化細菌M13培養15d后，瓶壁上的細菌數量增多，菌苔增厚，同時發酵液顏色發生改變，變成淡粉色，表明有色素類物質產生。與甲醇相比，甲烷作為碳源顏色變化更加明顯，說明含粉紅色素的菌體細胞聚集到了一起。

2.2 甲烷氧化細菌M13固態培養生長情況

2.2.1 甲烷氧化細菌M13的菌落形態 以1/1000濃度的菌液涂布接種，接種量為10%，在固體培養基中培養5d后進行觀察，結果如圖5所示。

由圖5可知，甲烷氧化細菌M13培養5d后，其菌落較大，呈乳白色，顯圓形，表面光滑明亮。

圖5 甲烷氧化細菌M13的菌落形態Fig.5 The colony morphology of M13

2.2.2 甲烷氧化細菌M13固態培養30d生長情況 將甲烷氧化細菌M13菌液稀釋100倍，接種量為10%。分別以甲烷和甲醇為碳源進行培養，30d后取出培養皿，結果如圖6～圖9所示。

圖6 以甲烷為碳源培養5d的M13平板Fig.6 Plating of M13 with methane as the carbon source after 5 days

圖7 以甲烷為碳源培養30d的M13平板Fig.7 Plating of M13 with methane as the carbon source after 30 days

圖8 以甲醇為碳源培養5d的M13平板Fig.8 Plating of M13 with methanol as the carbon source after 5 days

圖9 以甲醇為碳源培養30d的M13平板Fig.9 Plating of M13 with methanol as the carbon source after 30 days

由圖6～圖9對比可以看出，在甲烷為碳源條件下培養的細菌密度較大，數量較多，且經菌落計數法計算，菌落數約為4.4×104cfu/mL。而甲醇為碳源下培養的菌落數約為5.2×104cfu/mL，表明在固體培養基中，以甲醇為碳源培養甲烷氧化細菌M13較甲烷中生長更好。經30d的培養后，甲烷氧化細菌M13在甲烷和甲醇條件下均顯粉色，且在甲烷培養中的顏色變化比在甲醇中明顯，說明甲烷培養更適合色素的形成。

2.2.3 甲烷氧化細菌M13細胞形態的觀察 革蘭氏染色后的甲烷氧化細菌M13菌體細胞分別在40倍和100倍的顯微鏡下觀察。結果如圖10～圖11所示。

圖10 40倍顯微觀察下的M13菌體形態Fig.10 The cell morphology of M13 with 40×microscope

圖11 100倍顯微鏡觀察下的M13菌體形態Fig.11 The cell morphology of M13 with 100×microscope

由圖10～圖11可以看出，經革蘭氏染色后的菌體細胞呈紅色，說明甲烷氧化細菌M13是革蘭氏陰性菌。在甲烷與甲醇兩種不同培養條件下所生長的甲烷氧化細菌M13菌體形態大致相同，該菌體細胞個體均勻，呈短桿狀或略彎多數為單生。

2.3 不同碳源條件下甲烷氧化細菌M13生長曲線的分析

分別以甲烷和甲醇為唯一碳源進行培養，利用紫外分光光度計每隔6h測定其600nm的OD值，對其生長曲線進行記錄與分析。結果如圖12～圖13所示。

圖12 以甲烷為碳源的甲烷氧化細菌M13的生長曲線Fig.12 The cell growth curve of M13 with methane as the carbon source

圖13 以甲醇為碳源的甲烷氧化細菌M13的生長曲線Fig.13 The cell growth curve of M13 with methanol as the carbon source

由圖12～圖13可知，在以甲烷和甲醇為碳源的不同培養條件下，甲醇為碳源培養的甲烷氧化細菌M13進入對數生長期較甲烷早；同時在進入穩定期后，甲醇為碳源66h的OD600大于甲烷60h的OD600，表明甲烷氧化細菌M13以甲醇作碳源比甲烷作碳源的生長情況更好，因此甲醇更適合M13的生長和細胞合成。

3 結論

本文以甲烷氧化細菌M13作為研究對象，對其細胞形態和菌落形態進行觀察，并對不同碳源培養下細胞生長情況進行分析、檢測，為今后對這種或者此類的細菌的進一步研究打下了堅實的基礎。從菌落形態上看，甲烷氧化細菌M13菌落較大，呈圓形，乳白色，較為均勻，表面光滑明亮。在甲烷和甲醇條件下培養一段時間均產生粉紅色素，且在甲烷培養中的顏色變化比在甲醇中明顯；從細胞形態上看，甲烷氧化細菌M13的菌體呈短桿狀或略彎，細菌單生，是革蘭氏陰性菌；從菌體生長情況上看，甲烷氧化細菌M13在以甲烷和甲醇為碳源的不同培養條件下，甲醇為碳源條件下細菌生長的對數期長，甲烷為碳源進入穩定期比甲醇早，表明甲烷氧化細菌M13以甲醇作碳源比甲烷作碳源的生長情況好。

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[3]陳勁春，李珊，陶慧明，等.一株甲烷氧化桿菌的分離及其功能的初步研究[J].北京化工大學學報，1999，26（1）：9－10.

[4]Murrell J C，Gilbert B，McDonald I R.Molecular biology and regulation of methane monooxygenase[J].Arch Microbiol，2000，173（5/6）：325－332.

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[6]Whittenbury R， Phillips K C.Enrichment，isolation and some properties of methane utilizing bacteria[J].J Gen Microbial，1970，61：205－218.