發酵梨酒中產香酵母的分離、鑒定及生物學特性的研究

張大為，張 潔，洪磊東，張 丹，高 健，梁 芳

（1.湖南科技大學生命科學學院，湖南湘潭 411201；2.陜西科技大學生命科學學院，陜西西安 710021）

梨屬于薔薇科植物，果實味道鮮美，含有多種維生素、微量元素及人體所需必需氨基酸等營養物質，具有生津止渴、潤肺止咳的作用，是人們喜愛的常見水果之一。近年來，由于梨樹種植技術的大力推廣及國家對水果行業的重視，梨的種植面積及產量逐年增加。梨成為僅次于蘋果和柑橘的第三大水果，產量居世界第一位。我國梨主要分布在陜西、山東、河北、遼寧、安徽等地，成為很多地方的支柱產業之一[1]。由于梨主要以鮮食為主，加工技術相對落后，所以總體上來說是處于供過于求的局面，但是消費者平均占有量還不及世界平均水平的一半，主要原因在于還沒有從根本上解決水果行業發展的主要矛盾，即供求關系。開發梨酒是解決供求關系的一種行之有效的方法，同時也響應了我國關于酒業發展的指導思想，即以果酒逐步取代一部分糧食白酒的戰略構想[2]。酒的風味主要取決于酵母的性質，除釀酒酵母外，非釀酒酵母也在果酒釀造中起到了很重要的作用[3]。以前非釀酒酵母被認為是引起果酒腐敗的微生物，但近年來的研究證實了某些非釀酒酵母對酒的品質是有積極貢獻的，尤其是產香酵母對果酒中醇類、酯類物質的生成起著重要的作用，可賦予果酒濃郁的發酵香，與產酒率高的果酒酵母混合發酵可得到風味更佳的果酒[4－7]。本實驗從自然發酵的梨酒中分離得到的一株產香酵母，其產香濃郁，能在梨酒發酵中起到增香的作用。該菌種和本研究前期報道的釀酒酵母YDJ05配合使用，能起到增香的作用，也為利用YDJ05和該菌種進行原生質體融合來選育能夠產香的釀酒酵母奠定基礎[8]。本研究對該菌種的生物學特性進行了詳細的研究，并通過分子生物學手段鑒定到種，為后期進一步研究和在梨酒中的應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酥梨 陜西蒲城；麥芽汁培養基 陜西藍馬啤酒有限公司；自然發酵梨酒 將采集成熟的梨，制備梨汁，調整糖度15°Brix，經28℃自然發酵9d；發酵培養基 上述制得糖度為15°Bé的梨汁，115℃、20min滅菌備用；DNA凝膠回收試劑盒 購自Omega公司；其他如Tap酶、dNTPs等分子生物學試劑 由上海生工生物工程技術服務公司提供。

BSP－400型生化培養箱 上海博訊實業有限公司；SW－CJ－2F型超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備廠；AUY－120型分析天平 日本島津公司；PB－10型pH計 北京賽多利斯儀器系統有限公司；YXQ－LS－75SII型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SZX10攝影顯微鏡 日本OLYMPUS；MASTER－M型手持折光儀 日本ATGO；PTC200型PCR儀 美國BIO－RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的分離 取1mL自然發酵的梨酒，進行5個不同梯度的稀釋（10－1～10－5），制成菌懸液，涂布固體麥芽汁培養基平板，每個稀釋梯度涂布3個平板，經28℃培養2～3d。根據酵母的菌落及細胞特征（采用光學顯微鏡鏡檢），初步分離酵母菌并得到單菌落，保存至斜面培養基，編號并放入4℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 酵母菌的篩選 將上述斜面培養基中的酵母菌接入20mL發酵培養基的100mL三角瓶中，28℃培養2～3d后利用感官評定法選出產香濃郁且風味柔和的產香酵母菌，按GB/T 15038－2006測定發酵液的總酯、酒精含量、還原糖、總酸，再進行感官評定，篩選入選菌種。

1.2.3 入選產香酵母生物學特性的研究 包括產香酵母的細胞形態、生長曲線、最適培養溫度、最適pH、發酵過程中總酯的變化情況及耐受酒精的濃度。

1.2.3.1 細胞形態和生長曲線測定 將產香酵母菌按照10%接種量接入到發酵培養基中，定期測定培養液的OD值（660nm），以培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制生長曲線，同時制作菌株的水浸片，在光學顯微鏡下獲得顯微鏡照片（×40）。

1.2.3.2 最適培養溫度的確定 將酵母種子接入發酵培養基中，分別在20～34℃不同溫度下恒溫培養18h，在660nm下測定發酵液OD值，依照OD值大小確定其最適生長溫度。

1.2.3.3 最適pH的確定 選取pH范圍為3.5～5.9，其余同上。

1.2.3.4 總酯的變化情況 酵母的培養條件同上，每隔1d測定其產酯量。

1.2.4 產香酵母菌的分子生物學鑒定 26S rDNA D1/D2區序列分析。

1.2.4.1 DNA的提取 離心收集5mL菌體，用pH8.0的TE緩沖液洗滌三次，棄上清液，沉淀備用。

1.2.4.2 26S rDNA D1/D2區的PCR擴增及PCR擴增產物純化、測序[9]PCR擴增采用通用引物對ITS1（5’－GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG－3’）和TS4（5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’）。PCR反應體系（50μL）：10×PCR緩沖液，5.0μL；Mg2+（5mmol/L），3.0μL；dNTP（各5mmol/L），2.0μL；引物（20μmol/L）各1.0μL；Taq DNA聚合酶（1U/μL，MBI），1.0μL；模板2.0μL約20ng；去離子水35μL。擴增程序為：94℃，30s；52℃，30s：72℃，40s；30個循環后72℃ 8min。取5μL產物于1%的瓊脂糖凝膠電泳并在紫外燈下觀察結果。

1.2.4.3 系統發育樹分析[9]運用BLAST軟件在GenBank數據庫進行同源序列搜索，根據同源序列搜索結果下載相關菌種的D1/D2區域序列，與供試菌株序列放在一起，用MEGA4.1軟件進行匹配排列，采用鄰接法進行系統樹的構建，并用BOOTSTRAP程序進行1000次可信度分析。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離

按照1.2.1中的分離方法經過感官評定并配合顯微鏡鏡檢，分離得到46株具有產香能力的酵母其基本特征如表1所示。

表1 酵母的分離結果Table 1 Separation result of yeast

從分離結果來看，所得到的酵母特征與文獻報道的果酒酵母特征相類似，具有典型性[3－7]。通過初步感官評定，生長菌落的培養基平板能夠產生香氣，是進一步篩選的前提條件。

2.2 產香酵母的篩選結果

通過感官評定法在上述酵母菌中得到4株產香濃郁且風味柔和的產香酵母分別命名為YS01～YS04，其產酯、酒精等指標如表2所示。

表2 各菌株第5d發酵結果Table 2 The fifth day fermentation results of the strains

從表2可以看出，產香濃郁且風味柔和的酵母中，YS03的產酯量最高，達到了0.33g/L，產酒精率為0.8%（v/v），糖利用率較低，其糖濃度與還原糖量分別為12.1Brix和0.084g/L，說明在梨酒發酵中即不影響發酵菌株的酒精產量，又能達到增香的目的，是優良的梨酒增香酵母。

2.3 產香酵母生物學特性的研究

2.3.1 YS03的水浸片顯微照片如圖1所示。

圖1 菌株YS03的水浸片顯微照片（10×40倍）Fig.1 Microscopic photos of water extraction of YS03 strain（10×40）

由圖1可以看出菌株YS03具有典型的酵母形態，細胞均呈圓形或橢圓形，生殖方式為單端出芽生殖。

2.3.2 YS03的生長曲線 菌株YS03的生長曲線如圖2所示。

圖2 菌株YS03的生長曲線Fig.2 Growth curve of YS03

從圖2可看出，YS03的延遲期為0～4h，4h后進入對數生長期，直到16h后細胞數量趨于穩定，開始進入穩定期，經測定穩定期細胞數量為1.2×108個/mL。

2.3.4 YS03最適生長溫度的確定 YS03的在麥芽汁培養基中的生長曲線如圖3所示，其最適生長溫度為28℃，最適生長溫度的范圍為26～32℃，生長溫度范圍較寬。

圖3 YS03在不同溫度下的生長曲線Fig.3 Curve of YS03 growth at different temperature

2.3.5 YS03最適生長pH的確定 將YS03在28℃不同pH的梨汁中培養，其結果如圖4所示。

由圖4可看出，YS03的最適生長pH是5.5，在5.1～5.9之間均能生長較好，其適應性較強，與梨汁的自然pH非常接近。由于YS03長期生長在梨園的環境中，適應于梨自然的酸度，故在生產中不需要進行pH的調整，這樣既簡化了工藝流程，又減少了外來離子的干擾。

圖4 YS03在不同pH下的生長曲線Fig.4 Growth curve of YS03 at different pH value

2.3.6 YS03在發酵過程中總酯的變化情況 經感官初步評定以及發酵5d后的各項指標，確定YS03為產香酵母，其總酯的變化情況如圖5所示，在梨酒前酵的6d內，總酯含量逐漸增加，發酵的第6d的香氣最濃，其總酯含量達到0.38g/L，到第7d略有下降。

圖5 菌株YS03在發酵過程中的總酯變化曲線Fig.5 Changes curve of the total ester in the fermentation

2.4 YS03的26S rDNA D1/D2區序列的鑒定結果

圖6 菌株YS03基于26SrDNA D1/D2序列及Neighbor－Joining法構建的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree drawn from neighbor－joining analysis based on the 26SrDNA D1/D2 domain of YS03

YS03基于26SrDNA D1/D2序列及Neighbor－Joining法構建的系統發育樹如圖6所示，YS03（26SrDNA D1/D2序列登錄號為JN204428）和具有代表性的21株酵母進行比對發現，與模式菌株Issatchenkia orientalis NRRL Y－5396及Issatchenkia orientalis SM兩株酵母的相似度達到100%，故可斷定YS03和上述兩種酵母屬于同一個種，即東方伊莎酵母命名為Issatchenkia orientalis YS03。

3 結論

從自然發酵的梨酒中分離得到一株酵母菌YS03，該菌種產香濃郁，發酵速度較快，產酯率高，且糖利用率低，可以作為梨酒生產中的產香菌來使用。通過26S rDNA D1/D2區序列鑒定為東方伊莎酵母，命名為Issatchenkia orientalis YS03。

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