響應(yīng)面法優(yōu)化深黃被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的培養(yǎng)基條件

于新新，于長(zhǎng)青

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

花生四烯酸（Arachidoni acid，簡(jiǎn)稱(chēng)AA或ARA）屬于ω-6系列多價(jià)不飽和脂肪酸，是人體前列腺素合成的重要前體物質(zhì)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸已在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)花生四烯酸具有不受原材料和氣候限制、生產(chǎn)周期短、成本較低、產(chǎn)物含量高、分離提取容易等特點(diǎn)，因此受到了國(guó)內(nèi)外的重視，加拿大、日本等國(guó)家在這一方面研究的較早較多[4-5]，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，而我國(guó)尚處于起步階段。最近很多學(xué)者嘗試添加外源油脂、花生餅粉等復(fù)合氮源來(lái)提高ARA的產(chǎn)量，但是這不能從根本上解決成本問(wèn)題[6-7]。玉米黃漿水主要來(lái)自玉米淀粉糖工業(yè)，含有大量的玉米蛋白和少量的玉米淀粉，是一種便宜易得的原料。在發(fā)酵的培養(yǎng)基中添加一定量的玉米黃漿水可以達(dá)到降低發(fā)酵成本的目的，同時(shí)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量無(wú)顯著性影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生四烯酸菌種 深黃被孢霉YZ-124，本實(shí)驗(yàn)室篩選、分離、保藏，菌種于PDA斜面保存，每3個(gè)月轉(zhuǎn)接一次；斜面培養(yǎng)基 選用成品PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基 葡萄糖10%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.3%，酵母膏0.2%，硫酸銨0.2%，pH6.0，121℃滅菌20min；產(chǎn)脂培養(yǎng)基 葡萄糖10%，磷酸二氫鉀0.2%，硫酸鎂0.05%，酵母膏0.2%，檸檬酸鈉0.2%，pH6.0，121℃滅菌20min。

BCN-1360型超級(jí)潔凈工作臺(tái)、HGCE-F160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；GC9900型氣相色譜儀 上海科創(chuàng)色譜儀器有限公司；JD100-3B型電子分析天平 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；10L全自動(dòng)發(fā)酵罐 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 搖瓶培養(yǎng) 菌種在斜面培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)7d，待孢子大量轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑螅?℃冰箱保存。取5mL無(wú)菌水洗下孢子，然后注入裝有100mL種子基本培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，分別添加0、25%、50%、75%比例的玉米黃漿水（玉米黃漿水與種子培養(yǎng)基的體積比），溫度為28℃，轉(zhuǎn)速180r/min振蕩培養(yǎng)2d。

1.2.1.2 發(fā)酵罐培養(yǎng) 待種子長(zhǎng)好后按20%的接種量接種到發(fā)酵罐中，然后分別添加0、25%、50%、75%比例的玉米黃漿水（玉米黃漿水與種子基本培養(yǎng)基的體積比）。10L罐裝入6L發(fā)酵液，通氣量為3VVM，攪拌速度為180r/min，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)7d。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 菌體生物量的測(cè)定 將培養(yǎng)了7d的發(fā)酵罐內(nèi)的菌體取出來(lái)進(jìn)行分組離心，去上清液，再用蒸餾水洗滌2～3次，取沉淀物，放入75℃的烘箱中烘干至恒重，測(cè)得菌體的生物量（干重）。

1.2.2.2 油脂的提取測(cè)定 將干菌體用研磨器研成粉末后用索氏提取法提取，有機(jī)溶劑選擇乙醚，在80℃下提取6h，最后回收乙醚，100℃下干燥至恒重[8－9]。

1.2.2.3 氣相色譜分析花生四烯酸 待測(cè)樣品的處理：取0.3g的油脂放入15mL刻度試管中，按每克油脂加入15mL 0.5mol/L KOH－CH3OH溶液，65℃水浴加熱水解40min，冷卻后按每克油脂加入15mL 14%BF3－CH3OH溶液，水浴加熱5min甲酯化，冷卻后向試管中加入正己烷1.5mL，充分振蕩，加入去離子水，振蕩?kù)o止分層，取上層清液0.5μL進(jìn)行氣相色譜分析[2]。

氣相色譜分析條件：上海科創(chuàng)色譜儀器有限公司提供的GC9900型氣相色譜儀；色譜柱：FFAP交聯(lián)石英毛細(xì)管柱；檢測(cè)器：FID；載氣：氮?dú)猓?0mL/min）；溫度：進(jìn)樣口溫度160℃，檢測(cè)器溫度240℃；柱溫：160℃升至200℃（8℃/min），恒溫7min，降至160℃（2℃/min）；進(jìn)樣量：0.5μL。

1.2.3 培養(yǎng)基條件的優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以葡萄糖濃度（X1）、玉米黃漿水量（X2）、pH（X3）為自變量，花生四烯酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的二次回歸方程實(shí)驗(yàn)擬合自變量和花生四烯酸產(chǎn)量之間的函數(shù)關(guān)系。采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 The level and coding of experimental factors

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

本文研究了葡萄糖濃度對(duì)深黃被孢霉YZ－124產(chǎn)花生四烯酸的影響，結(jié)果如圖1。

從圖1可以看出，隨著葡萄糖量的增加，菌體、油脂量及花生四烯酸產(chǎn)量均增加，但當(dāng)糖濃度大于90g/L時(shí)菌體量開(kāi)始下降，這可能是由于隨著葡萄糖濃度的升高，碳源增加，相應(yīng)的碳氮比值變大，導(dǎo)致培養(yǎng)基的滲透壓升高，從而影響了微生物的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響菌絲的生長(zhǎng)，其相應(yīng)的發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量必然降低，因此對(duì)本實(shí)驗(yàn)而言，葡萄糖濃度應(yīng)該保持在90g/L左右比較理想。

圖1 不同葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響Fig.1 Effect of different glucose concentrations on fermentation product

2.2 玉米黃漿水添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

玉米黃漿水接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響，結(jié)果如圖2。

圖2 不同玉米黃漿水的添加量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響Fig.2 Effect of different addition of waste water from maize paste on fermentation product

從圖2可以得知，隨著玉米黃漿水添加比例的不斷增大，生物量、油脂量及ARA產(chǎn)量均出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，這主要是由于玉米黃漿水中淀粉含量較少，若大量添加到培養(yǎng)基中，造成培養(yǎng)基中可直接利用的碳源減少，導(dǎo)致三者產(chǎn)量下降；同時(shí)發(fā)酵時(shí)間也明顯延長(zhǎng)，在工業(yè)化生產(chǎn)中不利于降低發(fā)酵成本。因此，玉米黃漿水與基本培養(yǎng)基的體積比為25%時(shí)為最佳培養(yǎng)條件。

2.3 初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

本實(shí)驗(yàn)調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH分別為5、6、7、8對(duì)深黃被孢霉YZ－124進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，研究不同初始pH對(duì)發(fā)酵造成的影響，結(jié)果如圖3。

從圖3可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH對(duì)該菌株的細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)油脂和花生四烯酸產(chǎn)量都有較大的影響，當(dāng)初始pH為6時(shí)，菌體的各種發(fā)酵產(chǎn)物含量達(dá)到最大，隨著pH的繼續(xù)增加，各項(xiàng)指標(biāo)下降較明顯。對(duì)于深黃被孢霉來(lái)說(shuō)，較低的pH有利于油脂的積累[6]，對(duì)ARA在油脂中含量的增加也有促進(jìn)作用，綜合實(shí)驗(yàn)考慮，本實(shí)驗(yàn)選用pH6作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳pH。

圖3 不同的初始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響Fig.3 Effect of different initial pH on fermentation product

2.4 回歸模型的建立及分析

2.4.1 模型的建立 按照二次回歸方程實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件及結(jié)果Table 2 The result and condition of experiment

應(yīng)用Design Expert 7.1軟件，對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，可得葡萄糖濃度（X1）、玉米黃漿水添加量（X2）、初始pH（X3）與ARA產(chǎn)量的二次多項(xiàng)回歸方程：ARA產(chǎn)量=3.08＋0.14X1－0.049X2＋0.081X3－0.012X1X2－0.14X1X3＋0.11X2X3－0.15－0.13X22－0.13。對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可以看出，ARA產(chǎn)量的失擬值大于0.05，這說(shuō)明其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾較小，模型能較好的反映數(shù)據(jù)；而ARA產(chǎn)量的p＜0.05，這說(shuō)明方程與實(shí)際情況擬合良好，能夠反映ARA產(chǎn)量與葡萄糖濃度、玉米黃漿水的添加量、初始pH之間的關(guān)系，同時(shí)模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9456，說(shuō)明94.56%的變化可以通過(guò)該模型解釋?zhuān)虼丝梢岳么四Ｐ蛯?duì)培養(yǎng)基對(duì)ARA產(chǎn)量的影響進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.4.2 優(yōu)化的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析 應(yīng)用Design Expert 7.1分析軟件可得到三個(gè)影響因子之間的響應(yīng)面分析圖，葡萄糖濃度、玉米黃漿水添加量、初始pH對(duì)ARA產(chǎn)量的影響。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

在初始pH為6時(shí)，玉米黃漿水添加量（X2）和葡萄糖濃度（X1）對(duì)ARA產(chǎn)量的影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖4。

圖4 玉米黃漿水添加量和葡萄糖濃度對(duì)ARA產(chǎn)量影響的響應(yīng)面Fig.4 Response surface of effect of waste water from maize paste adding and glucose concentrations on ARA production

由圖4可知，當(dāng)葡萄糖濃度從80g/L到90g/L，玉米黃漿水添加量從0到25%時(shí)，ARA產(chǎn)量隨二者的增加而升高；葡萄糖濃度從90g/L到100g/L，玉米黃漿水添加量從25%到50%時(shí)，ARA產(chǎn)量隨二者的增加而下降。結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖濃度為90g/L、玉米黃漿水添加量為25%時(shí)，ARA產(chǎn)量達(dá)到最大。

在葡萄糖濃度為90g/L時(shí)，玉米黃漿水添加量（X2）和初始pH（X3）對(duì)ARA產(chǎn)量的影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖5。

圖5 玉米黃漿水添加量和初始pH對(duì)ARA產(chǎn)量影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of effect of waste water from maize paste adding and initial pH on ARA production

由圖5可知，當(dāng)玉米黃漿水添加量從0到25%，初始pH從5到6時(shí)，ARA產(chǎn)量隨二者的增加而增大；玉米黃漿水添加量從25%到50%，初始pH從6到7時(shí)，ARA產(chǎn)量隨二者的增加而減少，在玉米黃漿水添加量為25%，初始pH為6時(shí)，ARA產(chǎn)量達(dá)到最大。

在玉米黃漿水添加量為25%時(shí)，葡萄糖濃度（X1）和初始pH（X3）對(duì)ARA產(chǎn)量的影響的響應(yīng)面見(jiàn)圖6。

圖6 葡萄糖濃度和初始pH對(duì)ARA產(chǎn)量影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface of glucose concentrations and initial pH on ARA production

由圖6可知，當(dāng)葡萄糖濃度從80g/L到90g/L，初始pH從5到6時(shí)，ARA產(chǎn)量隨二者的增加而增加；葡萄糖濃度從90g/L到100g/L，初始pH從6到7時(shí)，ARA產(chǎn)量隨二者的增加而減少，要使ARA產(chǎn)量達(dá)到最大，葡萄糖濃度為90g/L，初始pH為6。

通過(guò)該組圖對(duì)任何兩因素交互影響ARA產(chǎn)量的效應(yīng)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，并從中確定最佳因素水平。從圖4～圖6可以看出，較高的ARA產(chǎn)量集中在中心區(qū)域，最高濃度可以達(dá)到3.11g/L。各因素對(duì)ARA產(chǎn)量的影響從大到小依次為葡萄糖濃度、初始pH、玉米黃漿水添加量。等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反[10]。由圖4～圖6所知，玉米黃漿水添加量和葡萄糖濃度交互作用不顯著，玉米黃漿水添加量和初始pH交互作用顯著，葡萄糖濃度和初始pH交互作用顯著。

利用軟件Design Expert 7.1對(duì)培養(yǎng)條件工藝進(jìn)行優(yōu)化，ARA產(chǎn)量為指標(biāo)，葡萄糖濃度為94.78g/L，玉米黃漿水添加量為19.32%，初始pH為5.97時(shí)，ARA產(chǎn)量可達(dá)3.12g/L。根據(jù)實(shí)際情況，考慮到生產(chǎn)成本，在理論值的基礎(chǔ)上，本文做了大量的驗(yàn)證試驗(yàn)，最后得出葡萄糖濃度為90g/L，玉米黃漿水添加量為25%，初始pH為6時(shí)ARA產(chǎn)量可達(dá)3.11g/L，與理論預(yù)測(cè)值比較誤差為0.3%。表明Central－composite模型優(yōu)化可成功用于深黃被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)ARA發(fā)酵條件的優(yōu)化，所得參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的使用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究，確定了深黃被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的培養(yǎng)基的最佳條件為：葡萄糖濃度為90g/L，玉米黃漿水添加量為25%，初始pH為6，在此條件下ARA的實(shí)際產(chǎn)量達(dá)到3.11g/L。

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