紫杉烯合酶基因遺傳轉化金針菇的研究

康林芝，林俊芳，2，黃秀琴，郭麗瓊，2，*，梁 科

（1.華南農業大學食品學院生物工程系，廣東廣州510640；2.華南農業大學生物質能研究所，廣東廣州 510640）

金針菇（Flammulina velutipes（Fr.）sing）屬于典型木腐生菌類，以其菌蓋滑嫩、柄脆、營養豐富、味美適口而著稱于世。據測定，金針菇氨基酸的含量高于一般菇類，尤其是賴氨酸的含量特別高，而賴氨酸具有促進兒童智力發育的功能，故金針菇也稱益智菇。同時，金針菇干品中含蛋白質8.87%，碳水化合物60.2%，粗纖維7.4%，經常食用可防治潰瘍病。金針菇既是一種美味食品，又是較好的保健食品[1]。金針菇基因工程方面的研究也有所報道，張介馳等[2]克隆了金針菇免疫調節蛋白基因并轉化感受態大腸桿菌DES（BI21），經IPIG誘導該基因在大腸桿菌DES（BI21）中獲得了大量表達。楊培周等[3]克隆了金針菇gpd-Fv啟動子；Cheng等[4]用金針菇gpd啟動子與多功能纖維素酶基因連接構建了表達載體pgFvs-mfc轉化灰蓋鬼傘，得到了高效表達多功能纖維素酶的轉化子。Kuo等[5]利用電擊法將EGFP（增強綠色熒光蛋白）基因轉化金針菇，EGFP得到了穩定表達。Maehara等[6]利用金針菇gpd啟動子構建表達載體轉化金針菇比以trpⅠ為啟動子的表達載體轉化金針菇效率提高了3倍。紫杉醇是四環二萜酰胺類化合物，是來源于紅豆杉的重要臨床抗癌藥物，其生物合成的研究在新藥開發上具有重要意義。紫杉醇生物合成是從二萜類共同前體香葉基香葉基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）開始，紫杉烯合酶（taxadiene synthase，TS），是紫杉醇生物合成途徑的第一個關鍵酶，催化GGPP形成紫杉二烯。Huang等[7]將異戊烯基焦磷酸異構酶（isopentenyl diphosphate isomerase）、牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶（taxadiene synthase）共轉化E.coli，實驗證明紫杉二烯可以在體內合成，且紫杉二烯的產量最大可達到1.3mg/L；在紫杉醇單基因異源表達的研究上，Anterola等[8]將紫杉二烯合酶基因導入苔蘚類植物physcomitrella patens中進行異源表達，成功獲得目的產物，這使紫杉醇的代謝合成成為可能。而紫杉烯合酶基因（ts）在大型真菌金針菇中的表達尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金針菇菌株FV－1（Fla7）購買于華中農業大學菌種廠，子實體為純黃色；表達載體pgFvs－Ts含有金針菇內源性gpd－fvs啟動子和紫杉烯合酶（Ts）基因，表達載體pgFvs－hph含有金針菇內源性gpd－fvs啟動子和潮霉素磷酸脫氫酶（hph）基因，兩個表達載體均為本實驗室所構建，表達質粒圖譜如圖1所示；MYG固體培養基配方 麥芽糖10g，葡萄糖4g，酵母粉4g，瓊脂粉20g，pH自然，溶于水中，加水至總體積為1L；MYG液體培養基的配制方法 MYG固體培養基中去掉瓊脂粉；溶壁酶（Lywallzyme）購自廣東省微生物研究所；潮霉素（Hygromycin B，HmB）美國Roche公司產品：PCR擴增試劑盒、RT－PCR擴增試劑盒 購自上海生工生物技術公司。

圖1 表達質粒pgFvs－hph（左）和pgFvs－Ts（右）圖Fig.1 The expression vectors of pgFvs－Ts（left）and pgFvs－hph（right）

1.2 金針菇原生質體的制備與再生

參照陳力力等[9]和周付忠等[10]的方法進行。

1.3 金針菇總DNA、RNA的提取

金針菇總DNA的提取參照Wang等[11]和白永宏等[12]的方法進行。金針菇總RNA的提取參照張潔等[13]的方法進行。

1.4 PCR引物

根據紫杉烯合酶基因（taxadiene synthase）的核苷酸序列設計了一對引物，擬擴增的片段大小為657bp，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物為：

上游引物巢式TS1：5’－ACA CCG TTT CGT GAG AGT TCT－3’（21bp）；

下游引物巢式TS2：5’－CAT CAG TAC ACA GGC AGT GGA－3’（21bp）。

1.5 PEG轉化法

參照郭麗瓊等[14]轉化灰樹花（Pleurotus ostreatus）、李剛等[15]轉化靈芝（Ganoderma lucidum）的方法，并進行改良。

將制備好的新鮮金針菇原生質體懸浮于40μL MMC buffer（25mL 1mol/L甘露醇溶液，12.5mL 0.2mol/L Maleate buffer，1.25mL 1mol/L CaCl2，11.25mL無菌去離子水）和10μL PEG buffer（25%PEG4000，10mmoL/L CaCl2，10mmoL/L Tris，pH7.4）中，使其終濃度為1×108個/mL；然后將質粒pgFvs－Ts和pgFvs－hph共轉化金針菇原生質體，質粒各3～5μg，另設一管不加質粒作為對照；并于每管中各加入12.5μL PEG buffer，冰浴20min；然后再加入0.5mL PEG buffer，混勻后28℃溫育15min；之后加入1.0mL STC buffer，4000r/min離心15min沉淀原生質體，最后重新懸浮原生質體于500μL MYG再生培養基中。25℃靜置培養3d，涂布含有60μg/mL潮霉素（HmB）的MYG再生平板。一般5～10d后轉化子在抗性平板上長出。

1.6 轉化子的分子生物學方法鑒定

質粒的提取與純化、PCR、RT－PCR等技術的操作，均根據分子克隆進行[16]。

2 結果與分析

2.1 金針菇擬轉化子的篩選

用pgFvs－Ts和pgFvs－hph質粒轉化金針菇FLa7，轉化后的原生質體在再生液體培養基靜置培養3d后涂布于含有60μg/mLHmB的MYG再生平板上，于25℃培養5d后，便可見到60個左右的再生菌落的出現（如圖2中A平板所示），而對照平板上（涂有不加pgFvs－Ts和pgFvs－hph質粒的轉化液的平板）則未長出菌落（如圖2中B平板所示）。將擬轉化子轉移到含有75μg/mL HmB的MYG平板進行二次篩選，在含有75μg/mL HmB的再生篩選培養基上，只有成功轉入質粒pgFvs－Ts和質粒pgFvs－hph的共轉化子或只轉入質粒pgFvshph的單轉化子才可以正常生長，經過二次篩選有18個轉化子可以在含有75μg/mL HmB的再生篩選培養基上生長。

圖2 金針菇擬轉化子在含有75μg/mL HmB的MYG平板上的生長情況Fig.2 The phenotype of putative transformants of Flammulina velutipes growing on MYG plate with 75μg/mL hygromysine

2.2 擬轉化子的PCR鑒定分析

為了初步檢測質粒pgFvs－Ts是否轉入金針菇中。將上述18個擬轉化子，提取其總DNA，用合成的引物（詳見1.4）進行PCR擴增并電泳。部分結果如圖3所示。

從圖3可以看出，有與陽性質粒擴增得到的條帶大小（約657bp）一致的轉化子，與所設計的PCR擴增的理論值657bp相符。說明該轉化子的基因組中已經含有ts基因片段，而沒有擴增出特異條帶的轉化子可能只有潮霉素基因（hph）的轉入。

圖3 金針菇擬轉化子基因組DNA的PCR擴增結果Fig.3 PCR amplif ication of genomic DNA from putative transformants

PCR結果顯示18個擬轉化子中有8個擬轉化子可擴增出657bp的目的條帶，與陽性對照的PCR電泳條帶大小相符。金針菇原種的陰性對照中無電泳條帶，因此初步判定紫杉烯合酶基因已經成功重組進入擬轉化子的基因組中。在18個擬轉化子中共有8個轉化子同時整合了紫杉烯合酶基因和hph基因，說明本實驗的共轉化率為44.44%。

2.3 轉化子的RT-PCR分析檢測

為了證明上述8株轉化子所擴出的條帶不是由于PCR擴增過程中某些因素導致的假陽性帶，將PCR鑒定正確的陽性轉化子菌絲體分別轉接，通過抽取總RNA，消化基因組DNA，分離mRNA，合成cDNA，以設計的引物進行PCR擴增，RT－PCR部分結果如圖4所示。

圖4 金針菇擬轉化子的RT－PCR擴增結果Fig.4 RT－PCR amplification of cDNA from putative transformants

RT－PCR結果顯示（圖4）經PCR鑒定正確的8個擬轉化子有7個擬轉化子能擴增出657bp的目的條帶，證明已經整合進宿主染色體中的目的基因實現正確轉錄。其中泳道8沒有擴增出對應條帶，陰性對照無條帶，說明這8株擬轉化子有7株紫杉烯合酶基因在轉錄水平能夠正常進行，而其中一株可能是由于插入位點不同引起基因沉默，沒有轉錄。這表明用PCR方法從轉化株擴增出的帶，確實是質粒pgFvs－Ts中的ts基因片斷而不是PCR反應擴增出的非特異性帶。通過潮霉素篩選實驗以及PCR、RT－PCR實驗結果證明已經有7株轉化子已將外源質粒pgFvs－Ts和pgFvs－Hph轉化進了金針菇中。

2.5 金針菇轉化子的遺傳穩定性

將PCR鑒定和RT－PCR鑒定正確的7株陽性轉化子和非轉化子先在不含HmB的MYG平板上連續傳代5代后，再接種到一個含有75μg/mL HmB的MYG平板上培養，5d后7株金針菇轉化子和非轉化子在抗性板上生長情況如圖5所示。從圖5可以看出，7株抗性轉化子在沒有選擇壓力的情況下，經連續多次傳代后都沒有喪失HmB抗性，初步證明它們都是穩定的轉化子。

圖5 7株金針菇轉化子轉接到含有75μg/mLHmB的MYG平板上生長5d后的結果Fig.5 The phenotype of transformants growing on the MYG plate with 75μg/mL hygromysine for 5 days

3 討論

金針菇是可食用的大型真菌，是健康的功能性食品，用其作為轉化表達的受體安全性較高，容易被廣大消費者接受；日本學者報道了從金針菇菌絲體中分離得到的4個側柏烯類型的倍半萜[17－18]，而且由圖6[19]可以看出，二萜類共同前體GGPP與倍半萜的合成具有共同的前體物質法尼基焦磷酸，正是由于倍半萜與二萜化合物合成具有部分相同或類似的代謝流，所以本文嘗試利用金針菇異源表達紫杉醇生物合成重要酶基因ts，結果表明了外源ts基因在金針菇轉化子中能夠正常轉錄，這為以后多基因組合導入金針菇生產紫杉醇提供了基礎，但是利用多基因組合轉化金針菇需要進一步的研究與探討。

金針菇菌絲每個細胞中含有兩個核，要獲得穩定的轉化子，需要進行至少3次的高濃度潮霉素的抗性篩選。本研究在初篩時采用60μg/mL的潮霉素進行篩選，之后把擬轉化子轉移到潮霉素濃度為75μg/mL的培養基上進行多次篩選，獲得的穩定遺傳的金針菇轉化子。

本實驗采用PEG介導法共轉化金針菇的原生質體，共轉化過程中兩個表達載體的共轉化率較低，利用潮霉素抗性作為選擇標記篩選轉化子時，容易出現不含有紫杉烯合酶基因的陽性轉化子，這種現象在共轉化過程中難以避免。提高共轉化率的方法有待進一步研究探索。

圖6 由異戊二烯焦磷酸生成萜類化合物的途徑[19]Fig.6 The biosynthesis pathway of terpenoid from Isoprene pyrophosphoric（IPP）

本研究通過轉基因金針菇連續繼代5代后對潮霉素抗性的檢測以及PCR擴增對目的基因的檢測，結果表明整合進金針菇的外源抗性基因hph和目的ts基因可以在金針菇中穩定遺傳，這說明金針菇作為外源基因表達系統是可行的。

[1]康健宜.金針菇——滿足兒童成長需要的“增智菇”[J].吉林蔬菜，2012，2（3）：45.

[2]張介馳，孔祥輝，張丕奇，等.金針菇免疫調節蛋白基因克隆及其表達[J].吉林農業大學學報，2007，29（5）：495-498.

[3]楊培周，郭麗瓊，王藝紅，等.毛柄金錢菌gpd-Fv啟動子的克隆及序列分析[J].工業微生物，2008，38（3）：33-37.

[4]Cheng SJ， Yang PZ， Guo LQ， et al.Expression of multifunctional cellulase gene mfc in Coprinus cinereus under control of different basidiomycete promoters[J].Bioresource Technology，2009，100：4475-4480.

[5]Kuo CY，Chou SY，Hseu RS，et al.Heterologous expression of EGFP in enoki mushroom Flammulina velutipes[J].Botanical Studies，2010，51（3）：303-309.

[6]Maehara T， Tomita S， Takabatake K.Improvement of the Transformation Efficiency of Flammulina velutipes Fv-1 Using the Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase Gene Promoter[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2010，74（12）：2523-2525.

[7]Huang Q L，Roessner C A，Croteau Rodney，et al.Engineering Escherichia coli for the Synthesis of Taxadiene，a Key Intermediate in the Biosynthesis of Taxol[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry，2001，9：2237-2242.

[8]Anterola A，Shanle E，Perroud P F，et al.Production of taxa-4（5），11（12）-diene by transgenic Physcomitrella patens[J].Transgenic Res，2009，18：655-660.

[9]陳力力，馬美湖，周傳云.不同因素對金針菇原生質體制備和再生的影響[J].生物技術，2005，15（5）：47-51.

[10]周付忠，賈身茂.金針菇原生質體的制備再生及其紫外線誘變的條件實驗[J].食用菌，1992（2）：8-9.

[11]Wang J， Guo LQ， Lin JF.Composition of Transgenic Volvariella volvacea Tolerant to Cold Stress Is Equivalent to That of Conventional Control[J].Agricultural and Food Chemistry，2009，57：2392-2396.

[12]白永宏，陳國梁，閆冬.幾種食用菌子實體總DNA提取方法的比較研究[J].安徽農業科學，2011（19）：11409-11410.

[13]張潔.一種改良的真菌總RNA提取方法[J].山西農業科學，2011（12）：1272-1273.

[14]郭麗瓊，王秀旭，舒薇.灰樹花gpd-Gf啟動子的功能分析[J].中國生物工程雜志，2007（6）：76-81.

[15]李剛，王強，劉秋云.利用PEG法建立藥用真菌靈芝的轉化系統[J].菌物學報，2004（2）：255-261.

[16]J薩姆布魯克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南（第二版）[M].北京：科學出版社，1992：1-1062.

[17]Ishikawa NK，Fukushi Y，Yamaji K，et al.Antimicrobial cuparene-type sesquiterpenes，enokipodins C and D from a mycelial culture of Flammulina velutipes[J].Journal of Natural Products，2001，64：932-934.

[18]Ishikawa NK，Yamaji K，Tahara S，et al.Highly oxidized cuparene-type sesquiterpenesfrom a mycelialculture of Flammulina velutipes[J].Phytochemistry，2000，54：777-782.

[19]陸錦池，陳榮山，劉長輝，等.淺述植物萜類物質的生物合成途徑[J].農業科技通訊，2009（3）：78-80.