ε-聚賴氨酸高產菌的新型篩選模型

孫湘婷，陳嬌婷

（贛南醫學院，江西贛州 341000）

ε-聚賴氨酸已于2003年10月被FDA批準為安全的天然生物防腐劑[1]。日本窒素公司已將ε-聚賴氨酸的微生物發酵實現工業化，市場規模達數十億日元[2]。但目前國內還處于實驗室研發階段，主要是進行ε-聚賴氨酸產生菌的誘變選育篩選高產菌株及發酵調控研究。傳統的ε-聚賴氨酸高產菌株篩選方法是通過菌株的平板分離獲得大量純培養物，然后隨機對每個純培養物進行搖瓶發酵測定產量，從而篩選獲得高產菌株。傳統篩選方法工作量十分龐大繁瑣且盲目隨機。ε-聚賴氨酸高產菌株的篩選方法有兩種：一種是在SG培養基中加入0.002%美藍，該方法簡單直觀，但美蘭對ε-聚賴氨酸產生菌產生很大的抑制作用，因此限制了其應用[3-5]。另一種方法是通過在培養基中加入S-（2-氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC），篩選得到抗AEC的高產菌株，但AEC價格十分昂貴，研究的AEC需要量較大，因此成本太高也限制了其應用[6-10]。本文提供一種簡單、直觀、經濟、快速的ε-聚賴氨酸高產菌的篩選模型，克服了傳統篩選模型的不足，大大地提高了篩選效率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株S.albulus KCTC 9669 中國工業微生物菌種保藏中心；溴酚蘭、百里酚藍、溴百里酚藍、中性紅、甲基紅、酚紅、甲酚紅、酚酞、百里酚酞、NaH2PO4·2H2O、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、NaCl、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NH4Mo7O24·4H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、明 礬 、H3BO3、K2HPO4、KH2PO4、甘油 國藥集團化學試劑有限公司；亮藍、檸檬黃、誘惑紅、莧菜紅 上海染料研究所有限公司；亞硝基胍 東京化成工業株式會社；AEC SIGMA公司；酵母浸出粉、麥芽浸出粉、葡萄糖、瓊脂 上海源聚生物科技有限公司；平板及斜面培養基（%）酵母浸出粉0.4，麥芽浸出粉1.0，葡萄糖0.4，pH7.3；SG固體培養基（%）[3]甘油1，瓊脂2，酵母浸出粉0.01，NaH2PO4·2H2O 0.0884，MgSO4·7H2O 0.025，（NH4）2SO40.066，痕量礦物溶液（培養基體積/礦物溶液體積=100/14），適量指示劑，pH7.0；痕量礦物溶液（%）NaCl 0.01，FeSO4·7H2O 0.01，CaCl2·2H2O 0.01，NH4Mo7O24·4H2O 0.001，CuSO4·5H2O 0.001，CoCl2·6H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.01，明礬0.001，H3BO30.001；種子及發酵培養基（M3G）[6]（%）葡萄糖5，（NH4）2SO41，K2HPO40.08，KH2PO40.136，MgSO4·7H2O 0.05，ZnSO4·7H2O 0.004，FeSO4·7H2O 0.003，酵母浸出粉0.5，pH6.8。

1.2 實驗方法

1.2.1 新型篩選模型指示劑的選擇 SG固體培養基中加入各指示劑溶液，使培養基中各指示劑終濃度均為0.002%，混勻后倒入90mm平板，制成各指示劑平板。將濃度為1g/L ε-聚賴氨酸標準品溶液200μL加入各指示劑平板的牛津杯中，以無菌蒸餾水為對照，1d后觀察平板。

1.2.2 新型篩選模型指示劑濃度的確定 SG固體培養基中加入終濃度為0.0002%～0.0040%的指示劑，將菌株S.albulus KCTC 9669的單孢子懸浮液適當稀釋，涂至各濃度的指示劑平板中。30℃培養箱靜置培養，觀察平板菌落生長情況。根據平板上菌落的生長情況及致死率確定添加指示劑的最佳濃度。

1.2.3 新型篩選模型的驗證 從亞硝基胍（NTG）誘變后的兩個指示劑平板A和B中各挑取透明圈徑大小不一的菌株進行搖瓶發酵，30℃培養4d。比較透明圈徑大小與菌株搖瓶發酵的ε-聚賴氨酸相對產量之間的關系。

2 結果與分析

2.1 新型篩選模型指示劑的選擇

圖1 新型篩選模型指示劑的選擇Fig.1 The selection of indicator for the new screening method

表1 新型篩選模型指示劑的選擇Table 1 The selection of indicator for the new screening method

由圖1和表1可得，在中性紅平板上，裝有ε-聚賴氨酸標準品的牛津杯周圍形成一個十分清晰明顯的色素透明圈。在誘惑紅、莧菜紅、亮藍、檸檬黃、溴酚蘭平板上，裝有ε-聚賴氨酸標準品的牛津杯周圍形成較清晰明顯的色素聚集圈。在酚紅、酚酞、百里酚酞、甲基紅、甲酚紅、百里酚藍、溴百里酚藍平板上也形成色素聚集圈，但不清晰，界限不明顯。由于中性紅平板所形成的色素透明圈最清晰，且界限最明顯，所以選擇中性紅為新型篩選模型的指示劑。

2.2 新型篩選模型指示劑濃度的確定

中性紅的濃度太低，所形成的透明圈就不清晰，界限不明顯；而濃度太高又會對菌體的生長產生一定的抑制作用，因此須確定合適的指示劑濃度，保證所形成的透明圈既清晰明顯又不會對菌體的生長造成較大的抑制作用。由表2可知，當中性紅濃度為0.0015%時，所形成的透明圈清晰明顯，而且對菌體生長影響很小（其中作為對照的0.002%的亞甲基蘭平板對菌的抑制率為91.8%，且第九天長出單菌落）。因此確定新型篩選模型中性紅終濃度為0.0015%。

表2 新型篩選模型指示劑濃度的確定Table 2 The determination of the concentration of indicator in new screening method

2.3 新型篩選模型的驗證

建立的新型篩選模型是否可靠，需要驗證ε-聚賴氨酸產生菌所形成的透明圈徑大小與ε-聚賴氨酸相對產量是否正性相關。由表3可知，同一平板上透明圈徑越大的菌株其ε-聚賴氨酸相對產量就越高。

表3 新型篩選模型的驗證Table 3 The testament of new screening method

3 結論

采用新型篩選模型可以通過目測直觀地從中性紅平板上篩選出ε-聚賴氨酸高產菌，而不用進行繁瑣的搖瓶發酵篩選，大大減小篩選工作量，提高了篩選效率；也不用采用昂貴的AEC，節約了成本，既經濟又高效，為ε-聚賴氨酸產生菌株和高產菌株的篩選工作提供了方便。

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