發(fā)光費(fèi)氏弧菌對(duì)常用色素的生物毒性評(píng)價(jià)

郭柔杉，李 翔，潘 力，*

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520）

發(fā)光細(xì)菌法（luminescence bacteria test，LBT）是一種具有快速、靈敏和廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)的直接生物毒性測試方法[1]。發(fā)光細(xì)菌法的原理是在熒光素酶的催化作用下，菌體中的還原型黃素單核苷酸（FMNH2）和分子氧及一長鏈醛發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成黃素單核苷酸（FMN）、羧酸（RCOOH）和水，并伴隨光釋放的過程。理化和生物有毒物質(zhì)會(huì)影響發(fā)光菌各類代謝從而改變發(fā)光強(qiáng)度。目前，該法常用于檢測化學(xué)無機(jī)毒性物質(zhì)[2]及有機(jī)污染物的毒性[3]，水體中人工合成抗生素[4]及生物殘留物[5]的單一及聯(lián)合毒性，以及重金屬類毒物[6-7]的毒性研究。而應(yīng)用于檢測食品中有害物質(zhì)生物毒性方面，除檢測三聚氰胺[8]外未見更多報(bào)道。因此，本研究擬以常見食品添加劑色素為對(duì)象，利用發(fā)光費(fèi)氏弧菌對(duì)其生物毒性進(jìn)行研究，通過發(fā)光抑制率的不同來比較不同色素的毒性大小，以期為食品急性生物毒性監(jiān)測的研究提供初步參考。目前常用色素包括天然色素和人工合成色素，以后者使用居多。而人工合成色素是用煤焦油中分離出來的苯胺染料為原料制成的，故又稱煤焦油色素或苯胺色素，如檸檬黃及日落黃等。按國家標(biāo)準(zhǔn)[9]規(guī)定，其在果汁飲料中最大使用量為0.1g/kg。這些人工合成的色素因易誘發(fā)中毒和腹瀉，還存在致畸和致突變的可能[10]。目前檢測色素的方法常見的有色譜法[11-12]、分光光度法[13]、單掃描示波極譜法[14]等，除卻前處理復(fù)雜和成本高等因素外，上述方法均以針對(duì)色素本身含量而進(jìn)行，而無法反映出含色素樣品的整體生物毒性。本研究則在綜合毒性的評(píng)價(jià)方面具有優(yōu)勢。本研究選取常用色素紅曲紅、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、亮藍(lán)和莧菜紅作為天然色素、偶氮類色素和二苯甲烷類色素的代表，通過研究其在水溶液中及在果汁中對(duì)發(fā)光費(fèi)氏弧菌發(fā)光量的抑制情況來評(píng)價(jià)其生物毒性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

費(fèi)氏弧菌（NRRLB－11177）購于ATCC；菌體保護(hù)劑 D－葡萄糖66g、NaCl 4.0g、L－組氨酸2.0g、BSA 0.5g，37℃溶于水，調(diào)pH（7.0±0.2），定容到100mL；凍干菌粉活化液 NaCl20g、MgCl2·6H2O 2.035g、KCl 0.30g，溶解后定容到1L，4℃保存；檸檬黃、紅曲紅、日落黃、胭脂紅、亮藍(lán)、莧菜紅 市售；液體培養(yǎng)基 NaCl 30g、NaH2PO4·H2O 6.10g、K2H2PO4·3H2O 2.75g、MgSO4·7H2O 0.204g、（NH4）2HPO40.5g、甘油3mL、胰蛋白胨5g、酵母膏0.5g、雙蒸水1000mL，調(diào)pH（7.0±0.2），分裝于錐型瓶中，高壓蒸汽滅菌121℃，20min。

SpectraMax M5多功能讀板機(jī) 美國Molecular Devices（MD）；Sartorius PB－10 PH計(jì) 德國Sartorius；Philips榨汁機(jī) 廣東中山飛利浦電子公司；SORVALL生物冷凍離心機(jī) 德國Sigma。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)光菌的培養(yǎng) 將發(fā)光費(fèi)氏弧菌接種于在瓊脂培養(yǎng)基生長，2～5d后挑取單菌落到新平板上生長，2～5d后接入含有50mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶，20℃，180r/min培養(yǎng)21h。

1.2.2 發(fā)光菌凍干粉制備 用預(yù)冷的離心機(jī)離心菌液，（4±2）℃，8000r/min，15min。棄上清液，用預(yù)冷氯化鈉溶液以10%比例重懸菌體。重復(fù)上述操作1～2次，將重懸后菌液轉(zhuǎn)入燒杯，置于冰上，緩慢以5%的比例加入保護(hù)劑，混勻。將此菌懸液凍干制備成菌粉，分裝后－20℃保存。并使用標(biāo)準(zhǔn)硫酸鋅溶液對(duì)凍干粉發(fā)光度的抑制率進(jìn)行驗(yàn)證，以確保菌粉發(fā)光情況正常。

1.2.3 費(fèi)氏弧菌測試方法 于制備好的凍干菌粉中每管加入100μL預(yù)冷無菌水，靜置10min。分別吸取10μL菌液至500μL活化液中，靜置15min后，測得費(fèi)氏弧菌原始發(fā)光量。將樣品梯度溶液和菌懸液加入96孔白板，采用2%濃度NaCl溶液為空白溶液，測定方法依照費(fèi)氏弧菌凍干粉檢測國際標(biāo)準(zhǔn)ISO11348－3的規(guī)定進(jìn)行，同一濃度樣品均平行測定3次，取其平均值后按照1.2.5所示方法計(jì)算發(fā)光度抑制率。

1.2.4 果汁的制備 將新鮮水果洗凈，切塊，榨汁，過濾，8000r/min離心5min，濾紙過濾取上清液，備用。

1.2.5 發(fā)光抑制率計(jì)算方法 發(fā)光抑制率Ht的計(jì)算公式見式（1）。

式中，Ht—平衡時(shí)間下，樣品對(duì)發(fā)光量的抑制率；Ict—加入被測樣品前發(fā)光菌被校正后的發(fā)光強(qiáng)度；It—樣品與發(fā)光菌在平衡時(shí)間下，發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度。

Ict的計(jì)算公式見式（2）：

式中，I0—被測樣品加入前發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度；—校正因子的平均值。

式中，fkt—校正因子；Ikt—空白溶液檢測孔的發(fā)光強(qiáng)度；I0—在加入空白溶液前發(fā)光菌的初始發(fā)光量；t—平衡時(shí)間；n—檢測孔數(shù)。

任一校正因子與平均值的偏差百分比計(jì)算公式見式（5）：

式中，fkti——校正因子中的任一值。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用origin8.0軟件中plot項(xiàng)繪制圖表，并用fitting中l(wèi)inear項(xiàng)進(jìn)行擬合，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。利用excel中STDEVP函數(shù)計(jì)算出每個(gè)樣品檢測3次后數(shù)據(jù)的誤差限，利用origin8.0軟件繪制Yerror圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度下各色素對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光度的影響

為了解色素濃度和費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率之間的關(guān)系，選取六種色素質(zhì)量濃度依次為1、5、50、100mg/L的溶液，觀察其對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光的抑制情況。將測得的抑制率與色素濃度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行線性回歸得到回歸方程，結(jié)果如圖1（a）所示。

研究發(fā)現(xiàn)六種色素溶液的質(zhì)量濃度與費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率之間呈正相關(guān)，回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2在0.8760～0.9873之間，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差限分析，結(jié)果如圖1（b）所示，其誤差限范圍在0.1595～6.6329之間。表1中體現(xiàn)出各色素回歸直線的詳細(xì)信息。

圖1 六種色素對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光的抑制效應(yīng)Fig.1 Inhibitory effect of six kinds of pigments on V.fischeri luminescence

表1 六種色素對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性Table 1 Inhibitory rate of pigments against luminescent intensity of Vibrio fisheri in aqueous solution

結(jié)果表明，各色素回歸直線的斜率k值表現(xiàn)為：檸檬黃最小，其次為亮藍(lán)，k值最大的為紅曲紅色素。即隨濃度增大，檸檬黃和亮藍(lán)的毒性增加最為平緩，而紅曲紅色素的毒性隨濃度增加，明顯增大。由回歸方程計(jì)算各色素的EC50值，即當(dāng)抑制率達(dá)到50%時(shí)所需的色素濃度值，用以作為毒性大小的評(píng)判參考。通過方程得到各色素的EC50值在0.72～2.86mg/L之間，其中檸檬黃值最大，莧菜紅值最小，表示在食用毒性上添加檸檬黃危害相對(duì)較小，而莧菜紅毒性相對(duì)較大。以上結(jié)果表明色素濃度與費(fèi)氏弧菌發(fā)光的抑制存在定量關(guān)系，因此可以利用費(fèi)氏弧菌發(fā)光法快速評(píng)價(jià)其生物毒性。

2.2 果汁中色素對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光度的影響

為研究色素添加到果汁中對(duì)發(fā)光菌的發(fā)光抑制情況，選取含有色素質(zhì)量濃度依次為1、5、50、100mg/L的果汁添加到費(fèi)氏弧菌活化液中，將測得的抑制率與色素的對(duì)數(shù)濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如圖2（a）所示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差限分析，誤差限范圍為0.1124～6.0794，如圖2（b）所示。根據(jù)回歸方程得到零等價(jià)劑量ZED[14]最大不超過0.04mg/L。

圖2 六種色素在果汁中對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度的劑量-效應(yīng)關(guān)系Fig.2 Inhibitory effect of pigments in fruit juice on V.fischeri luminescence

表2中體現(xiàn)出各果汁回歸直線的詳細(xì)信息。研究表明，測定果汁中的色素濃度越大，對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光度抑制率越高，兩者仍然呈現(xiàn)正相關(guān)。同時(shí)本研究根據(jù)ISO11348-3中對(duì)費(fèi)氏弧菌檢測中樣品制備的要求，已將鮮榨果汁的pH調(diào)節(jié)至6.0～8.5范圍，然后再添加色素，以此確保檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

表2 不同濃度色素在果汁中對(duì)費(fèi)氏弧菌的毒性Table 2 Inhibitory rate of pigments against luminescent intensity of Vibrio fisheri in fruit juice

研究表明，六種色素在果汁中對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光度的抑制關(guān)系線性相關(guān)系數(shù)在0.9136～0.9951之間。由回歸方程計(jì)算出EC50值在1.02～2.96mg/L之間，仍舊是檸檬黃的值最大，莧菜紅的值最小。EC50值的變化趨勢為：人工合成色素在果汁中的EC50增加，而天然色素的EC50降低，說明果汁對(duì)人工合成色素生物毒性具有一定的正面影響，對(duì)天然色素生物毒性具有一定負(fù)面作用。ZED值表現(xiàn)出，檸檬黃與紅曲紅色素在果汁中的生物毒性較其他色素要小。但本研究中市售天然色素紅曲紅并未如預(yù)計(jì)中出現(xiàn)極低的抑制率，反映出該色素在生產(chǎn)中可能添加防腐劑等其他成分，導(dǎo)致對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度出現(xiàn)明顯的抑制情況。

為綜合研究色素同一濃度下，在水溶液和果汁中對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光度的抑制情況，特將抑制率做如下對(duì)比，如圖4所示。

研究發(fā)現(xiàn)：首先，色素在果汁中對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制率均低于在水溶液中的情況，說明果汁對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光有一定保護(hù)作用。通過研究將鮮榨果汁單獨(dú)加入發(fā)光菌中，發(fā)現(xiàn)對(duì)發(fā)光抑制率出現(xiàn)了負(fù)增長，分別體現(xiàn)為：在梨汁中達(dá)到-12.3110%、蘋果汁中達(dá)到-8.0480%、橙汁中達(dá)到-5.1803%和柑橘汁中達(dá)到-7.5631%。其次，色素在果汁中對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率隨著色素濃度的增加而快速上升，其上升程度大于色素在水溶液時(shí)的影響。說明在果汁中添加色素量應(yīng)嚴(yán)格遵照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，否則少許超量將引起毒性大幅攀升。最后，無論色素所處溶液環(huán)境如何，均沒有改變相對(duì)的毒性高低，依然顯示檸檬黃毒性最弱，莧菜紅毒性最強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

研究表明，色素的生物毒性強(qiáng)度可以用發(fā)光菌法檢測。費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制率與色素的濃度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2在0.8760～0.9873之間。由EC50值發(fā)現(xiàn)，在食用毒性上添加檸檬黃危害相對(duì)較小，而莧菜紅毒性相對(duì)較大。

圖4 同一濃度色素在水溶液和果汁中對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率Fig.4 The inhibitory rate of six kinds of pigments in different concentrations against luminescent intensity of Vibrio fisheri in fruit juice

果汁中色素的生物毒性強(qiáng)度也可通過發(fā)光菌法檢測。費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制率與果汁的色素的濃度仍然呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)在0.9136～0.9951之間。注：1.每種色素對(duì)應(yīng)的并列兩柱中，左柱代表色素在水溶液中的發(fā)光抑制率，右柱代表色素在果汁中的發(fā)光抑制率；2.圖4a～d中色素濃度分別為1、5、50、100mg/mL。與費(fèi)氏弧菌檢驗(yàn)有機(jī)污染物等研究得到的結(jié)果相一致[2]，EC50值仍然表現(xiàn)出，檸檬黃毒性較小，莧菜紅毒性較大。且果汁對(duì)人工合成色素生物毒性具有一定正面影響，對(duì)天然色素生物毒性具有一定的負(fù)面作用。色素在果汁中對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光抑制率隨濃度增加而上升的幅度明顯大于在水溶液中。

上述結(jié)果表明色素對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度具有一定影響，體現(xiàn)為濃度和發(fā)光抑制率之間存在正相關(guān)性，提供了利用費(fèi)氏弧菌評(píng)估色素等食品添加劑生物毒性的初步方法，在評(píng)估未知樣品的整體毒性時(shí)優(yōu)勢則更明顯，成為可應(yīng)用于食品安全的生物檢驗(yàn)手段。

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