雙酶水解四角蛤蜊工藝優化研究

蔣金來，王令充，吳 皓，劉 睿，劉小莉，朱蘊菡，劉 新

（1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京 210046；2.南京中醫藥大學中藥學一級學科，江蘇南京 210046）

四角蛤蜊（Mactra veneriformis）為軟體動物門（Mollusca），瓣 鰓 綱（Lamellibranchia），蛤 蜊 科（Mactridae）的動物[1]，廣泛分布于我國南北各海區，生活于沿海的潮間帶，別名蛤剌、沙蛤、沙蜊，白蜆子等，其貝殼和軟體均可入藥，軟體部含有豐富的蛋白質和多糖等營養成分，且肉味咸寒，具有潤五臟、止消渴等功效[2]，是具有研究開發潛力的藥用海洋生物。隨著近代科學技術的進步和人們對海洋湖沼資源認識的提升，對海洋湖沼生物資源的研究開發不斷深入，已成為新產品研發的熱點之一[3]。對四角蛤蜊進行藥學研究和產品開發可以將低值海洋生物資源進行高值利用，具有重要的意義。近年來利用蛋白酶水解蛋白的研究日益劇增，對四角蛤蜊蛋白水解的研究亦逐步增加。目前對四角蛤蜊的酶解僅局限于單酶水解法[4]，采用的單酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶[5-6]，而對其雙酶復合水解[7]的研究尚未報道，蛋白質的水解不僅需要內切酶，而且需要外切酶的參與，內切酶只能將蛋白質水解為多肽及少量的氨基酸，外切酶是從肽鏈的N端或C端將多肽水解為氨基酸，所以在水解蛋白質時，要有內切酶和外切酶的雙酶共同作用才能得到高氨基酸含量的復合氨基酸液。本實驗采取內-外兩步酶解法水解四角蛤蜊，以期為海洋蛋白高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

四角蛤蜊 采自江蘇省南通茅家港，經清水吐沙后取鮮肉棄殼備用；胰蛋白酶活力5萬U/g，Amresco公司；胃蛋白酶（3000U/g）、木瓜蛋白酶（80萬U/g）、菠蘿蛋白酶（30萬U/g）、中性蛋白酶（5萬U/g）、酸性蛋白酶（5萬U/g）、堿性蛋白酶（20萬U/g）、風味蛋白酶（2萬U/g）、復合蛋白酶（12萬U/g）南京奧多福尼生物科技有限公司；其他化學試劑 均為分析純。

BP 211D型電子天平 德國Sartorious公司；RotavaporR－210型旋轉蒸發儀 德國BUCHI公司；pHs－3C型精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；JJ－2型組織搗碎勻漿機 江蘇省金壇市榮光儀器制造公司；Avanti J－25高速冷凍離心機 德國Backman公司；SHZ－III型循環水式真空泵 南京科爾儀器設備有限公司；Unique－s15型超純水儀 廈門銳思捷科學儀器有限公司；DF－101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市子華儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解液制備方法 將四角蛤蜊軟體洗凈泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次0.5h，瀝干，稱重，加3倍量水勻漿，再加入酶進行酶解，結束后于95～100℃水浴滅活10min，然后于6000r/min離心15min得上清液為酶解液。

1.2.2 測試指標與測定方法 氨基態氮含量用甲醛滴定法[8]測定；總氮回收率（%）=酶解液中氮含量/原料中總氮含量×100，酶解液和原料中總氮含量用凱氏定氮法[9]測定。

1.2.3 最佳內切酶的選取 在加酶量、固液比和酶解時間一定的前提下，用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和堿性蛋白酶7種酶酶解四角蛤蜊，以酶解液中氨基態氮含量和總氮回收率為評價指標，選出水解效果最好的內切酶。實驗設計見表1。

表1 不同內切酶的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions of different incision enzymes

1.2.4 內切酶條件優化 以1.2.3選取的酶解效果最好的酶為目標內切酶，以氨基酸態氮含量和總氮回收率作為指標，選擇酶用量、pH、溫度、時間等因素做單因素實驗，然后每個因素確定3個水平，按L9（34）正交表進行正交實驗，以優化內切酶解條件，正交實驗因素與水平見表2。

表2 正交實驗因素與水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 外切酶的篩選 在內切酶解液的基礎上做外切酶解實驗，當加酶量、固液比和酶解時間固定時，用風味蛋白酶和復合蛋白酶酶解內切酶解液，以最后酶解液中氨基態氮含量和總氮回收率水平評價效果最佳外切酶。實驗設計見表3。

表3 不同外切酶的酶解條件Table 3 Hydrolysis conditions of different excision enzymes

1.2.6 外切酶條件的優化 以1.2.5篩選的最佳酶解效果的酶為外切酶，以氨基酸態氮含量和總氮回收率作為指標，在單因素實驗的基礎上，選擇酶用量、pH、溫度、時間四因素并每個因素選取3個水平，按L9（34）正交表進行正交實驗，以優化外切酶解條件。正交實驗設計見表4。

表4 正交實驗因素與水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal experiment

2 結果與討論

2.1 內切酶的選擇

從表5中可以看出，7種內切酶中，中性蛋白酶的酶解效果最好，胰蛋白酶和堿性蛋白酶次之，其他四種酶的酶解效果較差，由此確定中性蛋白酶為目標內切酶。

表5 不同內切酶的酶解效果比較Table 5 Effect of incision enzymes on the hydrolysis of Mactra veneriformis

2.2 內切酶單因素實驗

2.2.1 酶用量對酶解效果的影響 結果見圖1，如圖1示，當底物量一定時，隨著酶用量的增加，酶解液中氨基態氮含量和總氮回收率迅速增加，當酶用量大于1500U/g肉時，酶解液中氨基態氮含量和總氮回收率增加量逐漸降低，且變化量很小，說明對水解效果的影響已開始減弱，這是因為隨著水解產物的增加，酶活力開始受到抑制，同時，考慮到成本因素，酶用量應以1500U/g為宜。

圖1 酶用量對酶解效果的影響Fig.1 Effect on enzyme dosage on the hydrolysis of Mactra veneriformis

2.2.2 溫度對酶解效果的影響 溫度影響蛋白酶催化反應速度及其穩定性，從而影響酶解反應的效率。為此，設定固液比1∶3，酶用量為1500U/g肉，初始pH為7.0，分別在40、45、50、55、60℃條件下酶解，4h后測定水解液中氨基態氮含量和總氮回收率，結果見圖2。

圖2 溫度對酶解效果的影響Fig.2 Effect of temperature on the hydrolysis of Mactra veneriformis

如圖2所示，隨著溫度的升高氨基酸態氮含量和總氮回收率不斷增加，50℃時均達到最大值，繼續升溫，氨基態氮含量和總氮回收率反而降低。這是因為溫度過高，引起了酶分子結構次級鍵解體，導致蛋白質變性，使得酶活力減弱[10]。因此，酶解的適宜溫度為50℃。

2.2.3 時間對酶解效果的影響 時間影響蛋白酶酶解程度及其酶活力，從而影響酶解反應的效果。為此，設定固液比1∶3，酶用量為1500U/g肉，初始pH為7.0，于50℃下分別酶解2、4、6、8、10h，然后測定水解液中氨基態氮含量和總氮回收率，結果見圖3。

圖3 時間對酶解效果的影響Fig.3 Effect of time on the hydrolysis of Mactra veneriformis

從圖3中可知，隨著時間的延長，酶解液中氨基態氮含量和總氮回收率逐漸增加，當酶解6h后，酶解液中氨基態氮含量和總氮回收率增加量變少，說明酶活力開始減弱，因此應酶解6h為宜。

2.2.4 pH對酶解效果的影響 設定固液比1∶3，酶用量為1500U/g肉，溫度50℃，分別在初始pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0條件下酶解，6h后測定水解液中氨基態氮含量和總氮回收率，結果見圖4。

圖4 pH對酶解效果的影響Fig.4 Effect of pH on the hydrolysis of Mactra veneriformis

圖4結果表明，由于目標內切酶是中性蛋白酶，因此在中性條件下，對四角蛤蜊的酶解效果最好。當pH為7.0時，氨基酸態氮含量和總氮回收率最高，故酶解的適宜初始pH為7.0。

2.2.5 固液比對酶解效果的影響 分別設定固液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，加酶量為1500U/g肉，溫度50℃，在初始pH7.0條件下酶解6h，滅酶后測定酶解液中氨基態氮含量和總氮回收率，結果見圖5。

圖5 固液比對酶解效果的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on the hydrolysis of Mactra veneriformis

由圖5可以看出，隨著固液比的增加，氨基酸態氮含量和總氮回收率有一個先升后降的漸變趨勢，這是因為固液比過大，會使酶解產物增量太快，反過來抑制酶解反應，并且固液比對酶解效果的影響不是很明顯。故實驗最終將固液比定為1∶3（g/mL）。

2.3 內切酶解條件優化

在單因素實驗基礎上，考慮到以上各因素對酶解效果的綜合影響，選擇酶用量、pH、溫度、時間四因素三水平L9（34）進行正交實驗，確定中性蛋白酶最佳酶解條件，正交實驗結果見表6和表7。

由表6中R值及表7中方差分析可知，綜合氨基態氮含量、總氮回收率兩個指標，影響內切酶解效果的主次因素為加酶量＞溫度＞時間＞pH，其最優條件是A2B1C2D3，進一步顯著性檢驗表明，加酶量對酶解效果具有顯著性影響（p＜0.05）。因此根據正交實驗分析結果，四角蛤蜊肉內切酶解最適宜條件為加中性蛋白酶1500U/g肉，調初始pH7.5，于45℃下酶解6h。

表6 正交實驗設計與結果Table 6 The results of orthogonal experiment

表7 內切酶水解氨基氮含量方差分析Table 7 Incision enzymes hydrolysis amino nitrogen content of variance analysis

2.4 外切酶解的篩選

在內切酶解液基礎上進行下一步酶解以篩選最佳外切酶，從表8可以看出，風味蛋白酶和復合蛋白酶比較，后者的氨基氮含量和總氮回收率均明顯高于前者，因此確定復合蛋白酶為外切酶。

表8 不同外切酶的酶解效果比較Table 8 Effect of excision enzymes on the hydrolysis of Mactra veneriformis

2.5 外切酶解條件的優化

根據文獻報道[11-13]及單因素實驗，在中性蛋白酶酶解液基礎上選擇溫度、pH、加酶量、時間四因素三水平按L9（34）進行正交實驗，以優化外切酶解條件，正交實驗結果見表9和表10。

由表9中R值及表10中方差分析可知，各因素對外切酶解效果的影響程度為pH＞加酶量＞時間＞溫度，其最優條件是A1B3C3D3，其中pH為外切酶解效果顯著性影響因素（p＜0.05）。因此根據正交實驗分析結果，外切酶解最適宜條件為加復合蛋白酶4200U/g肉，調初始pH7.0，于45℃下酶解11h。在此內-外兩步酶解條件下，四角蛤蜊肉酶解產生氨基態氮含量為20.78mg/g，其總氮回收率為88.19%。

表9 正交實驗設計與結果Table 9 The results of orthogonal experiment

表10 外切酶水解氨基氮含量方差分析Table 10 Excision enzymes hydrolysis amino nitrogen content of variance analysis

3 結論

以四角蛤蜊為原料，用氨基酸態氮含量和總氮回收率為指標，通過對比實驗確定四角蛤蜊內-外兩步酶解的酶種，并在單因素實驗的基礎上，通過正交實驗確定了內-外兩步酶解的最佳條件為：先添加中性蛋白酶1500U/g肉，酶解溫度45℃，固液比1∶3（V/W），初始pH7.5，水解6h，滅活后改變條件，溫度45℃，初始pH7.0，固液比1∶3（V/W），添加復合蛋白酶4200U/g肉，在此條件下酶解11h。通過實驗驗證，中性蛋白酶和復合蛋白酶內-外兩步酶解具有較好的水解效果，可酶解產生氨基氮含量為20.78mg/g，其總氮回收率為88.19%。

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