大蒜果聚糖水解酶全長cDNA的克隆

何林乾，黃雪松

(暨南大學理工學院食品系，廣東廣州510000)

果聚糖(fructan)廣泛存在于植物中，是由蔗糖與一個或多個果糖分子聚合而成的多聚體。研究表明，果聚糖是高等植物中一類重要的貯存物質或滲透調節物質，可以提高植物的抗逆性。目前已經發現的高等植物中的果聚糖的類型包括:菊糖型果聚糖，由β－2，1糖苷鍵連接;梯牧草型果聚糖，由β－2，6 糖苷鍵連接［1－2］;混合型果聚糖，是前兩種果聚糖的混合體，含分支。根據經典模型［3］，果聚糖水解酶(FEH)主要負責果聚糖水解。大蒜(Allium sativum L.)中含有多種形式的果聚糖，這種果聚糖形式的多樣性預示著大蒜中存在果聚糖的合成和分解兩種相反的生物代謝過程［4－5］。1－果聚糖水解酶(1－FEH)主要負責菊糖型果聚糖(inulin)的水解，已經在大蒜的鱗莖中分離出具有這種活性的1－FEH［6］。不同植物物種中的FEHs已被克隆和分析:菊科如Vernonia herbacea(一種生于巴西的菊科植物)［7］、H.tuberosus(菊 芋)、Cichorium intybus(菊 苣)［8］;禾 本 科 如Triticum aestivum(小 麥)［9－10］、Lolium perenne(黑 麥草)［11］、Bromus pictus(雀麥屬)［12］、Beta vulgaris L.(甜菜)［13］、Arctium lappa(牛蒡)［14］。這幾種植物 FEH 純品都是通過cDNA克隆與測序的方法獲得FEH基因后，再于畢赤酵母等微生物中表達，經過分離純化獲得的。而對于大蒜果聚糖酶的研究，僅有關于大蒜果聚糖外切酶的一些酶學特征的研究。而利用基因工程的方法克隆并表達大蒜FEH的基因的報道，國內外尚未見到。研究大蒜水解酶，及大蒜中果聚糖［EC3.2］的含量，有重要的商業價值和產業應用價值。本實驗的目的在于克隆出大蒜中 FEH的cDNA，并分析其功能，以為進一步研究FEH基因在果聚糖代謝中的表達情況、FEH在貯存保鮮或加工的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜(Allium sativum L.)山東金鄉產，購于廣州市石牌農貿市場;感受態大腸桿菌DH5α、PMD－19 T Vector 均購自 TaKaRa公司;RNAiso Plus、PrimeScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Ex Taq、DNA Marker、3'－Full RACE Core Set Ver.2.0、5'－Full RACE Kit 寶生物工程(大連)有限公司產品;苯酚、氯仿、異丙醇、乙醇等 為國產分析純試劑;液氮。

PCR儀 德國Eppendorf AG;核酸蛋白測定儀德國Eppendorf AG;JY600+電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司;SHA－B水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市宏華儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 大蒜總RNA的提取 切取15～30mg超低溫凍結的大蒜鱗莖組織，迅速轉移至－80℃預冷的研缽中研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀后，加入適量RNAiso Plus，再依次使用氯仿、異丙醇抽提，RNA沉淀用75%的乙醇清洗后溶于RNase－free水中，保存于－80℃。

檢測RNA的純度和完整性。測定所獲RNA樣品的OD260和OD280以及2.0%凝膠電泳凝膠判斷RNA的純度和完整性。

1.2.2 合成cDNA第一條鏈 根據試劑盒PrimeScriptⅡ1st Strand c DNA Synthesis Kit的方法，以獲得的 RNA為模板，以 oligo(dT)為引物，合成cDNA第一條鏈。

1.2.3 大蒜FEH基因的中間片段的擴增 根據已知的高等植物FEH基因的保守氨基酸序列NWMNDPNGPM和WECPDF設計引物 Gl－FEHa、Gl－FEHb(表1)，以cDNA為模板進行PCR反應。PCR條件為:94℃預變性 5min;94℃ 30s，50℃ 30s，72℃1min，35個循環;72℃延伸7min。用Ex Tag DNA合成酶。

將PCR產物克隆到PMD－19 T載體上，并利用感受態大腸桿菌DH5α細胞進行陽性篩選。提取質粒純化。對插入的DNA序列送上海生物工程公司測序，測序序列命名為DegeFEH－16。

1.2.4 c DNA全長擴增 利用c DNA末端擴增技術(RACE)獲取大蒜果聚糖的cDNA全長。5'RACE擴增:根據已獲得的DegeFEH－16的 DNA序列，設計引物 CTF333 R2、CTF333 R3(表1)。按照TaKaRa 5'－Full RACE Kit試劑盒說明，將處理好的Total RNA與 5'Adaptor連接后，反轉錄合成cDNA，同時設立M－MLV(－)對照。用CTF333 R2與5'RACE Outer Primer進行 Outer PCR，用 CTF333 R3與5'RACE Inner Primer進行Inner PCR。PCR條件為:94℃預變性 3min;94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，30個循環;72℃延伸10min。

3'RACE擴增:根據已經獲得的DegeFEH－16的DNA序列，設計引物 CTF333 F1、CTF333 F3(表1)。Total RNA 與 3'Adaptor后，，使用 TaKaRa 3'－Full RACE Core Set Ver.2.0將RNA反轉錄成cDNA，同時設立M－MLV(－)對照。用 CTF333 F1與3'RACE Outer Primer進行 Outer PCR，用 CTF333 F3與 3'RACE Inner Primer進行 Inner PCR。PCR條件為:94℃預變性 3min;94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min，30個循環;72℃延伸10min。

經RACE擴增后的PCR產物均進行切膠回收，并使用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2.0中的連接酶，將回收產物與pMD20－T Vector連接，熱轉化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37℃過夜培養。挑選陽性菌落，提取質粒進行測序。

1.2.5 序列拼接、RACE序列驗證 將獲得的ORF部分序列、5'序列和3'序列用DNAstar分析軟件進行全長拼接。根據得到的全長序列，設計并合成引物CTF333 F5、CTF333 R8(表 1)，用反轉錄產物進行PCR。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 序列結構分析及同源性分析 應用SignalP 3.0Server和ExPASy等對cDNA全長序列進行序列分析，包括尋找ORF，推導編碼氨基酸序列、預測信號肽及其保守結構域。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

將所獲得的大蒜FEH基因的cDNA序列及編碼的氨基酸序列放入NCBI的GenBank中進行BLAST，分析其和已收錄植物FEH的同源性。用軟件Clustal X和MEGA 4.0程序中的鄰接法(Neighbor－Joining，NJ)構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取結果檢測

提取大蒜總RNA進行2%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示。從電泳結果看，總RNA的28s和18s兩條帶較為清晰，表明RNA降解不嚴重，完整性較好。檢測總RNA樣品A260/A280為2.04，純度符合實驗要求。綜合以上檢測結果，提取的RNA可以用于反轉錄。

圖1 總RNA的瓊脂糖電泳凝膠Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA

2.2 中間片段DegeFEH－16的PCR結果

經過PCR得到大小在500～750bp之間的中間片段(圖2)，經質粒測序，得到569bp的基因序列。將序列在NCBI中 BLAST檢索，該序列與已收錄的FEH序列有高度同源性。

2.3 3'RACE結果

經反轉錄和PCR反應后，將反應液進行瓊脂糖凝膠電泳(圖3A)。經質粒測序得到1134bp的3'端未知序列。

2.4 5'RACE結果

經反轉錄和PCR反應后，將反應液進行瓊脂糖凝膠電泳(圖3B)。經質粒測序得到185bp的5'端未知序列。

圖2 DegeFEH－16的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DegeFEH－16

圖3 RACE產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of product of RACE

2.5 cDNA全長拼接和RACE序列驗證

將利用PCR得到的中間基因序列和通過RACE PCR方法獲得的3'和5'端序列，用DNAStar軟件拼接，獲得了全長1900bp的序列，序列為(陰影部分是CDS區):

用引物CTF333 F5和CTF333 R8進行PCR驗證RACE的結果，產物進行凝膠電泳(圖3C)。經驗證，得到的5'和3'序列是根據已知序列得到的。

2.6 cDNA全長序列分析、同源性比對和系統進化樹構建

用DNAstar將獲得的全長基因序列翻譯成氨基酸序列為:

經ExPASy軟件在線分析計算，所獲序列全長1900bp，編碼區(CDS 區)位于 33～1700bp，共編碼555個氨基酸，信號肽的長度是27個氨基酸。其編碼蛋白分子量和等電點pI分別為63453u和5.79。

將已獲得的氨基酸序列與GenBank中已收錄的其它高等植物FEH氨基酸序列相比對，該序列與禾本科植物的有較高的同源性，與小麥 FEH(BAE44509.1)同源性為53%，與黑麥(AAZ29514.1)的同源性為 52%。另外，與石刁柏(Asparagus officinalis)的一種細胞壁轉化酶(BAF93492.1)同源性為64%，與石刁柏的6－酮糖水解酶(BAF93491.1)同源性為62%。

用軟件Clustal X比對所獲的氨基酸序列與其他植物的FEH氨基酸序列，所獲序列含有保守氨基酸序列WMNDP、RDP和WECVD。(圖4)

圖4 大蒜和其他已知高等植物的FEH的保守氨基酸序列比對結果Fig.4 Comparison of deduced amino－acid sequence of FEH from Allium sativum L.with FEHs reported from other plants

用MEGA 4.0程序中的鄰接法(Neighbor－Joining，NJ)構建系統發育樹如圖5所示。

圖5 基于大蒜和其他已知高等植物的FEH的氨基酸序列的系統進化樹Fig.5 Phylogenetic analysis ofAllium sativum L.FEH with related FEH

3 結論

3.1 如上所述，我們獲得的cDNA序列全長1900bp，含1668bp的CDS區，編碼555個氨基酸的多肽鏈，經ExPASy軟件分析預測其蛋白分子量為63453u，該分子量與已報道的、經SDS－PAGE測得大蒜1－FEH的分子質量［6］、即61700u基本一致。

3.2 本文所獲得的氨基酸序列中，包含WMNDP、RDP和WECVD三個保守氨基酸序列，與已知的菊苣、牛蒡、黑麥及小麥等植物的FEH中的保守序列基本吻合。這也表明所獲上述基因應當是FEH。我們注意到:擴增中間片段時，利用的是已知保守氨基酸序列NWMNDPNGPM和WECPDF，與最終獲得的序列中相應序列不能完全對應，但這既可能是因為大蒜中三個功能區的氨基酸序列與已知的FEH保守序列不完全一致，也可能是因為利用氨基酸序列設計引物時有兼并堿基、或基因測序時有個別堿基的突變。其具體原因有待進一步研究證實。

3.3 本實驗獲得的氨基酸序列與小麥、黑麥的FEH同源性為53%。根據高等植物中果聚糖的研究［2］，菊粉型果聚糖(1－FEH)主要存在于雙子葉植物中，如菊芋、菊苣，而梯牧草型果聚糖(6－FEH)常見于單子葉植物中，如禾本科的小麥。一般同屬一科的植物，FEH同源性較高，如同屬菊科的牛蒡，與菊苣的同源性為82%，與斑鳩菊的同源性為80%，但與菊苣中的另一FEH同源性僅為53%［14］。屬不同科的植物，一般FEH同源性較低，如藜科的甜菜與菊科的菊苣的同源性只要55%。所以只能對不同物種間的FEH同源性高低做相對的比較。大蒜屬于百合科，單子葉植物，與禾本科同源性相對較近，但仍屬于不同的科。本實驗獲得的氨基酸序列與小麥、黑麥的FEH同源性(53%)高于屬雙子葉的菊科植物及甜菜。

3.4 本實驗獲得酶的序列與屬百合科的石刁柏中的轉化酶(invertase，蔗糖酶)有較高同源性，且高于其與FEH的同源性。根據已有研究，FEH不能降解蔗糖分子，需要通過細胞壁上的轉化酶(invertase)徹底水解，FEH可能是從轉化酶進化而來。分析已收錄的FEH的氨基酸個數約為560～580。而石刁柏中的轉化酶的氨基酸個數為750、739。可以排除本實驗所獲的555個氨基酸序列不是轉化酶。

3.5 基于以上已有大蒜1－FEH的研究結果、保守氨基酸序列、同源性等分析與討論，可以初步推斷本實驗得到的是大蒜中的FEH。但仍需要進一步通過異源表達、測定酶活性、反應物分析等進行驗證。

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