不同初始濃度的單增李斯特菌在營養肉湯中生長預測模型的建立

薩仁高娃，胡文忠，高春紅，姜愛麗，馮 可，馬 杰

(1.大連工業大學食品學院，遼寧大連116034;2.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連116600;3.大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧大連116024;4.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070)

單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenes，LM)是一種常見的人畜共患的食源性致病菌，能引起人畜的李斯特菌病［1］，廣泛存在于自然界的土壤、水、植物和反芻動物、人的糞便中，這種菌主要通過污染畜禽產品、蔬菜等食物而引起人類感染致病。由于該菌在4℃下的環境中仍可生長與繁殖，冷藏食品成為引發食源性疾病的主要病源［2］。預測微生物學(predictive microbiology)是一門結合微生物學、化學、數學、統計學和應用計算機技術的交叉性學科，它采用數學的方法描述不同環境條件下，細菌數變化和外部環境因素之間的響應關系，并對微生物的生長動力學做出預測［3］。國外根據預測微生物學開發了多種預測模型軟件，其中，PMP(Pathogen Modeling Program)是由美國農業部農業研究所開發的關于食品中微生物的生長預測軟件，操作簡捷，可用作微生物預測模型數據比較分析。目前，我國初步建立了LM的生長預測模型，大多數簡單建立LM在營養肉湯、冷鮮畜禽肉及其制品上的生長預測模型。國外研究較廣泛，建立了LM在畜禽及其制品，水產品和乳制品上的生長模型，近幾年國外多次暴發因果蔬被LM污染而引起的食源性疾病，因此開始建立LM在新鮮果蔬(如西瓜、木瓜［4］、卷心生菜［5］、蘆筍［6］等)上的生長預測模型。雖然研究范圍擴大，但國內外對初始濃度對單增李斯特菌生長的影響較少。本研究旨在建立不同溫度下不同初始濃度LM在營養肉湯中的生長預測模型，探究溫度和LM初始濃度對生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 LM標準菌株來自遼寧省疾病控制中心;牛津瓊脂(OXA)基礎 青島海博生物技術有限公司，取 5.85g OXA，加熱溶解于100mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，冷至50℃時，加入1支牛津瓊脂添加劑(多粘菌素E 2mg、放線菌酮40mg、吖啶黃素0.5mg、頭孢雙硫唑甲氧 0.2mg、磷霉素 1mg)，混勻，傾入無菌平皿，備用;營養肉湯(NB)青島海博生物技術有限公司，稱取18.0g NB，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min，備用;含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂(TSA－YE)青島海博生物技術有限公司，稱取51.0g TSA－YE，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，傾入無菌平皿，備用;實驗用水 均為蒸餾水。

1300系列A2型二級生物安全柜 美國Thermo Fisher Scientific公司;HR40－IIA2二級生物安全柜青島海爾特種電器有限公司;MLS－3020全自動高壓蒸汽滅菌器 日本SANYO公司;PL2002分析天平瑞士METTLER TOLEDO公司;Acol－super全自動菌落計數儀 英國synbiosis公司;DNP－9052電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;HYC－326A醫用冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司;YLE－1000電熱恒溫水浴鍋 北京東方精瑞科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原菌液的制備 在無菌室的生物安全柜里以無菌操作取TSA－YE斜面上的標準菌株，在TSA－YE無菌平板上平行劃線，36℃培養24～48h活化，挑取單菌落接種于含有150mL無菌NB的三角瓶中，充分混勻，將三角瓶放入36℃培養箱，培養24～48h至初始菌落數大致為105cfu/mL，即原菌液，4℃保存備用。

1.2.2 營養肉湯中LM計數 在無菌室中以無菌操作將原菌液充分混勻，取10mL加入到90mL無菌營養肉湯中，制得菌液濃度大致為104cfu/mL，再從104cfu/mL中取10mL菌液加到90mL無菌營養肉湯中，制得菌液濃度大致為103cfu/mL，同樣方法，將菌液梯度稀釋102cfu/mL。將三個稀釋度的菌液均放入36℃培養，每隔2h將三個稀釋度菌液取出，搖勻后用涂布平板培養法［7］計活菌數，平板用全自動菌落計數儀分析計數，重復三次。按下列公式計算每毫升樣品中的含菌量:每毫升樣品中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度3次重復的平均菌落數×稀釋倍數×10。同樣方法將原菌液稀釋成104、103、102cfu/mL三個稀釋度，分別放入4℃和26℃培養，用平板涂布培養法計數。其中4℃每隔24或48h取一次計數，26℃每隔5h取一次計數。

1.2.3 初級模型構建 初級模型利用Matlab軟件建立Gompertz模型和Logistic模型，選擇最合適的模型得出不同濃度LM菌懸液在不同溫度下的生長曲線，并得到相應的初級模型參數。生長曲線和模型參數均與PMP預測軟件進行比較。

式中:t表示時間(h)，Nt表示t時的菌數，A表示初始菌數N0(lg cfu/mL)，C表示最大菌數Nmax與初始菌數N0的差值(lg cfu/mL)，B為在時間點M時的相對最大生長速率(h－1)，M表示達到最大生長速率所需的時間(h)，U表示微生物生長的最大比生長速率(lg cfu/mL·h)，LPD表示微生物生長的延滯期(h)，MPD表示微生物生長的最大細胞密度(lg cfu/mL)，e=2.7182［8］。

2 結果與討論

2.1 LM在營養肉湯中生長的初級模型的選擇

不同濃度LM菌懸液的Gompertz模型在不同溫度下的擬合很好，相關系數均在0.98以上，Logistic模型擬合也較好，均在0.96以上，結果見表1。結果顯示，不同濃度LM菌懸液在不同溫度下的生長情況均能用Gompertz模型描述，因此選用Gompertz模型建立初級模型。

2.2 不同溫度下不同濃度LM在營養肉湯中的生長曲線

4℃下，Gompertz模型擬合的不同濃度LM在營養肉湯中的生長曲線見圖1。可以看出，初始菌濃度越低，菌的延滯期越短，較快進入對數期，隨著初始菌濃度的增高，曲線趨于平緩，則延滯期時間增加。初始菌數為102、103cfu/mL的生長曲線分別在約26、28h后進入對數期。對數期LM的生長速率隨著初始菌濃度的增加而減慢。最大菌體密度達到約104cfu/mL。

表1 不同濃度LM菌懸液的Gompertz模型和Logistic模型在不同溫度下的相關系數(R2)Table 1 The correlation coefficients(R2)of Gompertz model and Logistic model of the growth of L.monocytogenes under different temperatures and initial concentrations

圖1 4℃下Gompertz模型擬合的不同濃度LM在營養肉湯中的生長曲線Fig.1 Gompertz model curve of the growth of L.monocytogenes on nutrient broth under different concentrations at 4℃

26℃下，Gompertz模型擬合的不同濃度LM在營養肉湯中的生長曲線見圖2。菌的延滯期隨初始菌濃度的增加而縮短，初始菌濃度為102cfu/mL的曲線在約5h進入對數期，而103和104cfu/mL的生長曲線分別在約3和2h后就進入了對數期。和4℃時一樣，進入對數期的LM，生長速率隨著初始菌濃度的增加而減慢，初始菌濃度越低，對數期菌數增加速率越快。25h后，三個不同菌濃度的生長曲線達到最大菌體密度，約為105cfu/mL。

圖2 26℃下Gompertz模型擬合的不同濃度LM在營養肉湯中的生長曲線Fig.2 Gompertz model curve of the growth of L.monocytogenes on nutrient broth under different concentrations at 26℃

36℃下，Gompertz模型擬合的不同濃度LM在營養肉湯中的生長曲線見圖3。三個不同初始菌濃度的生長曲線均在約1～2h后進入對數期，LM的生長延滯期隨初始菌濃度的增加而縮短。進入對數期后，初始菌濃度越低，LM的生長速率越快。約在8h后進入穩定期，細胞密度達到最大值，約107cfu/mL。

圖3 36℃下Gompertz模型擬合的不同濃度LM在營養肉湯中的生長曲線Fig.3 Gompertz model curve of the growth of L.monocytogenes on nutrient broth under different concentrations at 36℃

2.3 LM在營養肉湯中生長的初級模型的模型參數

由Matlab軟件擬合LM在營養肉湯中生長的Gompertz模型，得到相應的生長參數:最大比生長速率U(lg cfu/mL·h)、生長延滯期LPD(h)和最大細胞密度MPD(lg cfu/mL)，結果見表2。

可以看出LM在4℃的最大比生長速率(0.0236，0.0078，0.0016)小于在 26℃的最大比生長速率(0.3169，0.1111，0.0595)，26℃的最大比生長速率小于36℃的最大比生長速率(1.3046，0.9287，0.7024)，證明隨著溫度升高，LM生長速度加快。4℃下，最大比生長速率隨著初始菌濃度的增加(102，103，104)而降低(0.0236，0.0078，0.0016)，26、36℃也顯示同樣的趨勢，結果證明，在相同溫度下，初始菌濃度越低，LM生長越迅速。

隨著溫度的升高，生長延滯期 LPD(h)縮短。LM在不同溫度下生長延滯期順序為:4℃(25.6811，27.3143，33.7437)＞ 26℃(4.8442，3.3708，2.3458)＞36℃(1.7875，1.1932，0.6915)。在相同溫度下，生長延滯期的趨勢并不明顯，26，36℃下，延滯期隨著初始菌濃度的增加而降低，而4℃下，延滯期隨著初始菌濃度的增加而延長，因為溫度較高時(26，36℃)，初始菌濃度越大，進入對數期就越快，延滯期越短;而溫度較低時(4℃)，初始菌濃度越大，越接近最大細胞密度，因此延滯期越長。

從最大細胞密度MPD(lg cfu/mL)可以看出，隨著溫度升高，MPD增大，LM在不同溫度下的最大生長密度順序為:36℃(7.7559，7.7709，7.7536)＞26℃(5.6839，5.7218，5.7076)＞ 4℃ (4.0969，4.0453，4.0492)。

LM在營養肉湯中生長的生長曲線于PMP軟件進行比較，MPD較低，但總體趨勢相同。初始濃度為103cfu/mL的LM生長參數的實測值和PMP預測值的比較見表3。可以看出，U和LPD的實測值和預測值趨勢相同，都是隨著溫度的升高，U增快，LPD縮短。MPD的實測值和預測值差別較大，可能原因是實驗選擇菌株的不同和單一造成的，該菌株可能受溫度影響較大，所以MPD達不到預測值，且隨著溫度降低，MPD減小。

表2 不同濃度LM菌懸液的Gompertz模型在不同溫度下的生長參數Table 2 Gompertz model parameters of the growth of L.monocytogenes under different temperatures and concentrations

表3 LM生長參數的實測值和PMP預測值的比較(初始濃度為103cfu/mL)Table 3 Comparison of observation and PMP predictive values on L.monocytogenes growth parameters

3 結論

本實驗利用Matlab豐富的函數資源，成功擬合出不同溫度和不同LM濃度在營養肉湯中的生長初級模型。微生物生長的初級模型一般通過S形曲線描述，主要模型有:Gompertz模型、Logistic模型、Richards 模型和 Baranyi模型等［9－10］。多數微生物生長預測模型研究表明，Gompertz模型能很好描述微生物的生長，Zhou［11］擬合了熱殺索絲菌(Brochothrix thermosphacta)的生長曲線，發現Gompertz模型最合適，其次是Baranyi模型，最后是Logistic模型。本文分別擬合了Gompertz模型和Logistic模型，比較相關系數發現，Gompertz模型的R2均在0.98以上，所以認為Gompertz模型能更好的擬合本實驗的數據。

基于前人的研究，本實驗選擇了三個不同溫度，36℃為LM最適生長溫度，26℃為室溫，4℃為食品冷藏溫度，研究結果具有指導意義。三個溫度下LM的生長曲線與PMP預測軟件比較發現，實測值與預測值存在一定差別，但總體趨勢相同。

近年來，較多研究都致力于建立不同溫度下LM的生長預測模型，如鄭麗敏［12］等建立了不同溫度下即食涼拌菜中單增李斯特菌的生長模型，而很少有研究初始菌濃度對LM生長的影響。本實驗基于目前生長預測模型研究的基礎，建立了不同初始濃度在不同溫度下LM在營養肉湯中生長的初級模型，明晰了LM增殖規律，為進一步研究鮮活農產品物流過程中LM的生長動態，研發綜合防控技術奠定了基礎。

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