醋酸桿菌發酵細菌纖維素及其改性研究

張 雯，趙秋紅，李彥軍

(陜西科技大學，陜西西安710021)

細菌纖維素(Bacterial cellulose，簡稱BC)是葡萄糖以β－1，4－糖苷鍵聚合成的高分子化合物，與自然界廣泛存在的植物纖維素相比，在純度、持水性、透氣性、物理和機械性能、生物相容性及生物可降解性等方面均具有獨特的優良性能。在食品、醫藥、輕工等行業具有廣泛的應用價值［1－4］。然而，BC 干燥后即成堅硬致密的半透明干膜，不易被液體滲透，吸水量相對較少，難以恢復到最初的溶脹狀態，使其優良特性被破壞，從而限制了其應用［5］。為改善BC的再溶脹能力，提高其材料性能，本研究通過兩種途徑對BC進行了改性:一是在發酵培養基中分別添加水溶性多糖—羧甲基纖維素、羧甲基淀粉鈉、海藻酸鈉發酵生產BC;二是將普通培養基中發酵生產的BC凝膠膜或干膜分別浸漬于多羥基化合物－1，3－丁二醇、N，N－二甲基甲酰胺、甘油中進行改性。從而改善了BC材料性能，促進了其開發應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醋酸桿菌(Acetobacter xylinum)本實驗室提供;固體培養基［6］蔗糖 5%，牛肉膏 1.5%，Na2HPO40.44%，檸檬酸0.08%，乙醇1.0%，pH5.0;種子培養基 蔗糖5%，牛肉膏1.5%，Na2HPO40.44%，檸檬酸0.08%，乙醇1.0%，pH 5.0;基礎發酵培養基 蔗糖5%，牛肉膏1.5%，Na2HPO40.44%，檸檬酸0.08%，瓊脂1.8%，乙醇1.0%，pH 5.0;改性培養基1 基礎發酵培養基添加羧甲基纖維素鈉(CMCNa);改性培養基2 基礎發酵培養基添加羧甲基淀粉鈉(CMSCNa);改性培養基3 基礎發酵培養基添加海藻酸鈉(AS)。

電熱恒溫培養箱(MG250B)、恒溫振蕩器(HYG－1A)上海新瑞儀器有限公司;光學顯微鏡(XPS－8CA)上海光學儀器有限公司;精密電子天平(BS110S)北京賽多利斯天平有限公司;全自動X－射線衍射儀 日本Rigalcu;傅立葉變換紅外光譜儀 德國Brucher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 BC的發酵改性 分別配制基礎發酵培養基及改性培養基1、改性培養基2、改性培養基3，接種醋酸桿菌(接種量10%，發酵液裝量200mL/500mL燒杯)，30℃靜態培養4d進行BC的發酵生產，發酵結束后測定產物持水率、孔隙率、透濕性及IR、XRD檢測。改性培養基中多糖添加量均為6個梯度:0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，每個樣品平行3份。所得改性后樣品記為樣品1#～樣品15#，對照組記為樣品0#。

1.2.2 BC的浸漬改性 配制基礎培養基發酵生產BC，發酵結束后將BC凝膠膜按1.2.3所述方法進行處理，分別浸漬在蒸餾水及多羥基化合物－丁二醇、二甲基甲酰胺、甘油中24h進行改性。浸漬結束后取出BC膜用蒸餾水充分水洗，所得改性后樣品記為樣品16#～樣品18#。測定改性后的BC持水率、孔隙率、透濕性及IR、XRD檢測。

1.2.3 測定分析方法

1.2.3.1 BC膜處理 將BC膜浸泡于0.1mol/L NaOH溶液中，80℃浸泡30min，繼續加熱煮沸約2h，再用蒸餾水反復沖洗，直到pH為7.2［6］。

1.2.3.2 BC膜持水率、復水率及產量測定 稱重法［7－8］。

1.2.3.3 BC膜孔隙率 用介質飽和法測定［7－8］。

1.2.3.4 BC膜透濕性 用水蒸汽透過率評價［7－8］。

1.2.3.5 BC鑒定及基團分析 紅外光譜(樣品處理:將BC膜烘干后研成粉末，與溴化鉀以1∶100比例混合充分研細，然后用壓片機壓片，再放入紅外光譜儀中進行測定)［9］。

1.2.3.6 BC膜結晶度 X－射線衍射光譜(樣品處理:將BC膜烘干后研成粉末，平鋪在涂有凡士林的玻璃平板上，然后將樣品放入X－衍射儀中，設定參數角為 20～40°)［9］。

1.3 數據處理方法

所有數據均用三次平行實驗的平均值表示，用SPSS(PASW Statistics18)軟件對數據進行處理，方差分析及多重比較中p＜0.05為顯著差異，記為*。

2 結果與分析

通過發酵培養基中添加CMCNa、CMSCNa、AS制備了 CMCNa－BC、CMSCNa－BC、AS－BC 3 種改性 BC膜，同時利用多羥基化合物—丁二醇、甘油和二甲基甲酰胺浸漬BC得到了三種浸漬改性膜，改性前后BC膜的持水性、復水性、孔隙率、水蒸氣透過率及IR、XRD檢測結果如圖1～圖9所示。

2.1 改性對BC膜持水性及復水性的影響

由數據分析及圖1、圖2可知，通過向發酵培養基中添加水溶性多糖對BC進行改性后，BC的復水率顯著提高，其中培養基中加入0.5%AS的改性BC膜(樣品11#)復水率可達96.58%，比改性前提高了30.3%;N，N－二甲基甲酰胺浸漬改性后BC膜(樣品18#)改性產物再次溶脹后的復水率可達97.40%，比未改性BC膜增加31.4%。同時，改性后的BC膜持水率也有所上升，其中培養基中加入1.5%AS(樣品13#)生產的BC膜持水率最高達98.53%，比改性前提高了2%。其原因主要在于，BC可以與水溶性多糖以糖苷鍵的形式結合從而改變其特殊網狀結構，改性BC膜通過干燥后的硬度會有所降低，因此可提高干膜再溶脹后的復水性。而多羥基化合物作為一種“膨脹劑”，可部分取代凝膠膜中持有的水分，這些“膨脹劑”在BC膜干燥時不會隨水分蒸發出去，阻止了除去水分對膜微結構的破壞，使之形成一種柔韌的膜，從而使BC干膜復水時在較短時間內可以恢復到原來的狀態。而其中甘油浸漬后BC膜的持水率及復水率均明顯降低主要是因為多羥基化合物可以部分或全部地取代凝膠膜中持有的水分，這些“膨脹劑”在BC膜干燥時不會隨水分蒸發出去。同時實驗結果表明，培養基中添加2.5%AS對BC膜合成有抑制作用，不能產生BC，其原因可能是因為發酵培養基中AS濃度過高，滲透壓過大，影響了細胞代謝生產BC。

圖1 發酵改性前后細菌纖維素的持水率Fig.1 Water holdup rate of bacterial cellulose before and after being modified

圖2 發酵改性前后細菌纖維素的復水率Fig.2 Rehydration rate of bacterial cellulose before and after being modified

2.2 改性對BC膜孔隙率及透濕性的影響

由數據分析及圖3、圖4可知，培養基中加入1.5%CMCNa發酵改性的BC膜孔隙率為0.9177%，比未改性的BC膜孔隙率增加了5倍。同時，發酵改性后BC膜的水蒸氣透過率均得到了不同程度的提高，培養基中加入1.0%CMSCNa發酵改性后BC膜水蒸氣透過率可達8967.2g/m2×d，比未改性的BC膜水蒸氣透過率增加了1倍。

圖3 發酵改性前后細菌纖維素的孔隙率Fig.3 Hole rate of bacterial cellulose before and after being modified

圖4 發酵改性前后細菌纖維素的水蒸氣透過率Fig.4 Water vapour transmission rate of bacterial cellulose before and after being modified

2.3 改性BC膜紅外光譜檢測

改性前后的BC膜紅外光譜圖如圖5～圖8所示，1059cm－1左右處的吸收峰是由碳氧鍵的伸縮振動引起的，是纖維素分子的特征峰。在3450cm－1左右處的吸收峰，反映了分子間氫鍵引起的O－H基的伸縮振動。在1500cm－1和2000cm－1之間的吸收峰是由纖維素4’端的半縮醛基引起的。在1645cm－1左右處的吸收峰是由C－H鍵伸縮振動引起的，強度與纖維素結晶度有關。而在2920cm－1左右處的吸收峰則是由CH2－CH伸縮振動產生的，在這個區域的吸收峰是糖類的特征吸收峰。在約900cm－1的吸收峰是糖苷鍵的特征峰。通過紅外光譜圖的對比，改性后多糖的確存在于細菌纖維素中。3450cm－1處O－H、C－H吸收峰的明顯增強較好地說明了羧甲基已經結合到了 BC 中。1606、1414、1645cm－1處的吸收峰，分別表明了羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉和海藻酸鈉成分的存在。

2.4 改性對BC膜結晶性的影響

圖5 改性前細菌纖維素的紅外光譜圖Fig.5 IR of the bacterial cellulose before being modified

圖6 N，N－二甲基甲酰胺改性后細菌纖維素的紅外光譜圖Fig.6 IR of the bacterial cellulose after being modified by N，N－dimethylformamide

圖7 培養基添加0.5%AS改性細菌纖維素的紅外光譜圖Fig.7 IR of the bacterial cellulose after being modified by 0.5%AS

圖8 培養基添加1.5%CMCNa改性細菌纖維素的紅外光譜圖Fig.8 IR of the bacterial cellulose after being modified by 1.5%CMCNa

改性前后的BC膜XRD光譜圖如圖9所示，除1，3－丁二醇浸漬改性BC膜，改性前及改性后的BC膜均能夠觀察到一個主峰，其對應的衍射角為22.27左右。在X－衍射中峰的比例反映了BC膜的結晶程度，由圖可看出，發酵改性后峰的比例不變，強度小的變動伴隨有角的改變，可知發酵培養基中添加水溶性多糖改性BC對其纖維素結晶影響不大。而1，3－丁二醇改性后BC膜XRD圖譜峰的比例減弱至幾乎消失，顯示BC膜結晶度降低。

圖9 改性前后細菌纖維素膜X－射線衍射光譜圖Fig.9 XRD of the bacterial cellulose before and after being modified

3 結論

通過培養基中添加水溶性多糖發酵生產BC及利用多羥基化合物浸漬BC能夠對BC進行改性，所得改性BC膜的持水性、復水性、孔隙率和透濕性等材料學特性均比改性前優良。培養基中添加1.5%AS所得改性BC膜持水率比改性前提高了2%;培養基中加入0.5%AS所得改性BC膜再溶脹能力比改性前提高了30.3%;N，N－二甲基甲酰胺浸漬改性所得BC膜比改性前提高了31.4%;培養基中加入1.5%CMCNa所得改性BC膜孔隙率比改性前提高了5倍;培養基中加入1.0%CMSCNa所得改性BC膜水蒸氣透過率比改性前提高了1倍;發酵改性作用對細菌纖維素的結晶度影響不大。該研究為制備高性能復合BC材料、拓寬BC的應用奠定了基礎。

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