納豆固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

甘 露，崔松松，倪敬田，曹媛媛，唐欣昀

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥230036)

納豆是一種傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品，具有抗血栓、降血壓、抗腫瘤等多種生理功能［1］，在各有效成分中最重要的是具有溶栓作用的納豆激酶(nattokinase，NK)［2］。納豆激酶具有安全性好、成本低、作用迅速、經(jīng)口服后可迅速入血、纖溶活性強、作用時間長等特點［3］。因此，研究提高納豆中納豆激酶的含量可以提高納豆功能性食品的營養(yǎng)和保健價值。目前，已有一些關(guān)于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶工藝條件的報道［4－7］，這些研究主要涉及固態(tài)發(fā)酵中有關(guān)輔料的配比、理化條件的優(yōu)化，多以產(chǎn)納豆激酶為主要指標。生產(chǎn)納豆功能性食品條件要求嚴格，需要使用完整的大豆，不能添加過多的輔料和化學(xué)藥品，僅有少數(shù)報道涉及納豆功能性食品固態(tài)發(fā)酵［8－10］，初步注意到在固體發(fā)酵中大豆顆粒的破碎程度與提高納豆中納豆激酶的活性有關(guān)［10］，但尚缺少大豆破碎度等因素與納豆激酶活性之間關(guān)系的詳細研究。本文將詳細研究在納豆固態(tài)發(fā)酵中包括大豆破碎度在內(nèi)的理化條件的影響，以納豆激酶活性為指標，采用 Plackett－Burman設(shè)計和響應(yīng)面法設(shè)計實驗，優(yōu)化發(fā)酵條件，為研發(fā)優(yōu)質(zhì)納豆功能性食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)BN－3菌株 由本實驗室篩選保存;纖維蛋白原、凝血酶sigma公司出品;其他試劑 均為國產(chǎn)或進口分析純;種子培養(yǎng)基［11］牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH7.2～7.4。

恒溫水浴鍋 江蘇省金云市榮華儀器制造有限公司;不銹鋼手提式滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠;紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液的制備 挑取經(jīng)斜面活化的納豆菌一環(huán)接到種子培養(yǎng)基中，在37℃，轉(zhuǎn)速為160r/min的搖床中培養(yǎng)12h。

1.2.2 工藝流程 大豆→清洗→浸泡→瀝干→滅菌(115℃高壓滅菌30min)→冷卻至室溫→接菌→發(fā)酵→后熟→取樣分析。

按照實驗設(shè)計定量接菌及設(shè)定發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間及后熟時間等參數(shù)。

1.2.3 納豆激酶粗酶液制備及活性測定方法 酶活測定參照Astrup纖維蛋白平板法［12］制備纖維蛋白平板。

尿激酶標準曲線的測定:配制不同濃度的尿激酶標準溶液。取上述各溶液的尿激酶標準溶液10μL點樣于纖維蛋白平板上，37℃培養(yǎng)12h，測量溶解圈的兩垂直直徑。以溶解圈的垂直直徑乘積為縱坐標，以標準尿激酶活力為橫坐標作標準曲線，方程是y=0.1523x+0.5025，R2=0.9847。

粗酶液制備及點樣:納豆固體發(fā)酵結(jié)束后，在每克納豆中加入質(zhì)量分數(shù)為0.9%生理鹽水2mL，4℃浸提12h，4500r/min離心20min，取上清液即所需的粗酶液。取15μL樣品點樣于纖維蛋白平板，37℃培養(yǎng)12h，測量溶解圈的兩垂直直徑。參照上述尿激酶標準曲線的方程計算樣品酶活。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 Plackett－Burman法篩選影響發(fā)酵的主要因素［5］納豆激酶固態(tài)發(fā)酵的影響因素包括大豆起始含水率、大豆破碎度、培養(yǎng)基起始pH、物料厚度、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、后熟時間等。實驗選用N=12的Plackett－Burman設(shè)計安排，對這8個因素進行研究，另外3個因素為虛擬變量。實驗設(shè)計的每個因素取2個水平，根據(jù)前期實驗確定各因素的水平，各因素水平取值見表1。

1.3.2 最陡坡實驗 根據(jù)Plackett－Burman實驗所篩選出的各顯著因素效應(yīng)值的大小來確定最陡上升路徑，而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負和大小，正效應(yīng)的因素均取較高值，負效應(yīng)的因素均取較低值［5］。

1.3.3 響應(yīng)面實驗 在對Plackett－Burman實驗結(jié)果充分分析的基礎(chǔ)上，在最陡坡實驗確定的區(qū)域內(nèi)，采用Box－Behnken響應(yīng)面設(shè)計方法，以NK酶活為響應(yīng)值對顯著因素進行優(yōu)化，各因素水平和編碼見表2。

表1 因素及水平Table 1 Factors and levers

表2 Box－Behnken響應(yīng)面設(shè)計實驗因素水平和編碼Table 2 Factors and levels in the Box－Behnken experimental design

表3 Plackett－Burman實驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Plackett－Burman test design and result

2 結(jié)果與分析

2.1 重要因素篩選

按實驗設(shè)計進行兩輪實驗，取兩次測量值的平均值為準，實驗結(jié)果見表3。各因素效應(yīng)及其顯著性見表4。

由表4可知，對納豆激酶產(chǎn)率有顯著影響的因素包括大豆破碎度、接種量和發(fā)酵溫度。由各因素的效應(yīng)還可看出，要提高納豆激酶酶活，應(yīng)降低發(fā)酵溫度，升高大豆破碎度和接種量。同時，還可以看出大豆含水率、物料厚度為正效應(yīng)，培養(yǎng)基起始pH、發(fā)酵時間、后熟時間為負效應(yīng)。因此在后續(xù)實驗中大豆含水率、物料厚度取高水平，培養(yǎng)基起始pH、發(fā)酵時間、后熟時間取低水平。

表4 因素及效應(yīng)Table 4 Factors and effects

2.2 最陡坡實驗

表5列出了各因素的變化方向、步長及實驗結(jié)果。由實驗結(jié)果可知，NK產(chǎn)率在1與2之間有一個明顯上升，之后開始下降，最優(yōu)發(fā)酵條件在1與2之間，故2條件為后續(xù)實驗的中心點。

表5 最陡坡實驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Steepest ascent test design and result

2.3 響應(yīng)面實驗優(yōu)化發(fā)酵條件

在最陡爬坡實驗確定的區(qū)域內(nèi)，以大豆破碎度、發(fā)酵溫度、接種量為自變量，以NK酶活為響應(yīng)值，經(jīng)軟件Design Expert8.0.6設(shè)計了3因素3水平共15個實驗點的Box－Behnken響應(yīng)面分析實驗。實驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Box－Behnken experimental design matrix and experimental results

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis for the fitted regression equation

通過Desgn－Expert 8.0.6軟件分析可以得到優(yōu)化后的響應(yīng)值的動態(tài)參數(shù)方程:

由表7分析結(jié)果表明，該模型的p=0.0146＜0.05，表明模型顯著:失擬項p=0.2901＞0.05，不顯著。回歸方程相關(guān)系數(shù)的平方為0.9391，說明建立的模型能理解響應(yīng)值變化的93.91%，模型擬合程度較好。

利用Desgn－Expert 8.0.6軟件求解方程最大值時，當破碎度為3.69、接種量7.9%、發(fā)酵溫度31.93℃時，NK酶活最高為2149.86U/g。根據(jù)實際要求，最終確定最佳發(fā)酵條件為破碎度4，接種量7.9%、發(fā)酵溫度32℃。為檢驗?zāi)Ｐ偷臏蚀_性，在最佳發(fā)酵條件下進行發(fā)酵實驗，三次實驗得NK酶活平均值為(2140.5±83.2)U/g，表明所得的模型具有一定的實驗指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

3.1 本文采用Plackett－Burman實驗設(shè)計方法，篩選出了影響納豆激酶固態(tài)發(fā)酵的3個顯著因素:大豆破碎度、接種量和發(fā)酵溫度。通過最陡爬坡實驗有效地逼近最大響應(yīng)區(qū)域。然后利用Box－Burman實驗設(shè)計及響應(yīng)面分析得到最優(yōu)發(fā)酵工藝:大豆破碎度4、接種量7.9%、發(fā)酵溫度32℃。經(jīng)驗證，在此條件下，納豆激酶酶活為(2140.5±83.2)U/g。

3.2 目前，關(guān)于納豆激酶固態(tài)發(fā)酵的研究報道主要涉及以蘋果渣或豆渣等為原料，添加尿素或麩皮等輔料，發(fā)酵納豆菌、生產(chǎn)納豆激酶［4－7］;而僅有少數(shù)研究涉及固態(tài)發(fā)酵納豆功能性食品。本文采用大豆為原料，未添加任何輔料，以納豆激酶活性為指標深入研究了在納豆固態(tài)發(fā)酵過程中理化條件的影響。

3.3 路龍女在納豆固體發(fā)酵和液體發(fā)酵條件的研究中初步探討了大豆破碎度與提高納豆中納豆激酶活性有關(guān)［10］。本研究由PB實驗結(jié)果得知大豆破碎度對提高納豆中納豆激酶活性具有顯著效應(yīng)。這可能是由于適當破碎大豆顆粒，有利于空氣流通及物料散熱，進而有利于納豆菌的生長及產(chǎn)酶。

3.4 一些研究涉及固態(tài)發(fā)酵納豆功能食品［8－10］，所得納豆中的納豆激酶酶活在976～2150U/g之間。本研究設(shè)計破碎大豆的新工藝，采用響應(yīng)面法優(yōu)化條件，在最佳發(fā)酵條件下獲得納豆激酶酶活為(2140.5±83.2)U/g，高于多數(shù)文獻報道的酶活，為研發(fā)優(yōu)質(zhì)納豆功能性食品、提高納豆中納豆激酶酶活提供技術(shù)參考和實驗數(shù)據(jù)。

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