二次回歸正交優化米棗中總黃酮和多酚提取工藝研究

黃 彭，郭 菲，何靖柳，李 靜，劉東杰，李 玉，秦 文，李素清

(四川農業大學食品學院，四川雅安625014)

棗(Ziziphus jujube Mill)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Ziziphus Mill)植物，是原產于我國的多年生落葉小喬木［1］。四川三臺嶄山米棗具有皮薄肉嫩、入口化渣、酸甜適中、滋陰補腎、健脾開胃等特點，更是成為了享譽川內外的名優水果［2］，被稱之為“中國米棗之鄉”［3］。但鮮食棗果實不耐貯藏，采摘后在自然狀態下很快失水、皺縮、腐爛，花色苷、VC等營養物質的含量也迅速降低［4］。棗果具有很高的食用和藥用價值，是“藥食同用”的上等補品。棗類植物果實中含有豐富的總黃酮、VC、花色苷［5］、多酚等抗氧化物質，但花色苷和VC容易受提取溫度、光照和氧氣等環境因素影響，在同等條件下優化提取偏差較大［6］。胡迎芬［7］在研究冬棗總黃酮提取工藝中采用正交優化3種不同處理方式最佳工藝條件所得抗氧化物相差不大，但振蕩提取方式時間較長，及其對·OH、DPPH·具有一定的清除能力。王雅［8］研究沙棗抗氧化物質利用超聲波輔助提取，優化后得最佳工藝為料液比1∶11.40，乙醇濃度48.10%，此條件下提取率最高;濃度過大，乙醇和多酚極性相差過大，導致一些水溶性的多酚、總黃酮不能溶出。郝會芳［9］研究表明，棗果中多酚類物質的提取工藝受料液比、溫度影響較大，清除DPPH·和鹽能力較強，但隨時間的延長，提取率降低。Ana Bucic'－Kojic'等人［10］用動力學實驗研究固－液提取葡萄籽中多酚，發現多酚提取得率受籽粒大小、料液比和提取溫度影響在14.72%～66.81%之間變化，建立Peleg方程后，提取條件使80%～90%多酚在40min內提取出來。Boonyadist Vongsak等人［11］研究最佳方式提取辣木屬油茶葉中抗氧化物質為多酚和總黃酮，兩者在體內和體外都具有較穩定的抗氧化活性。由于VC和花生苷在提取工藝操作中容易被氧化而使測得值在計算統計中誤差偏大，因此本實驗以米棗為試材，通過單因素實驗和回歸正交組合實驗［12］初步探究米棗中總黃酮和多酚的提取工藝條件，為米棗抗氧化物質提取提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米棗 2012年8月下旬采摘于四川三臺縣，挑選黃熟期、無病蟲害和機械傷、大小均勻的果實，運至實驗室冷藏庫4℃貯藏;蘆丁標準品 中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心;沒食子酸標準品上海江萊生物科技有限公司;Folin－clocalteu's 北京索萊寶科技有限公司。

GB023YSL－V2微波爐 佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司;KT－I 1730TD數控超聲波清洗機 溫州東大環保設備有限公司;SHZ－82數顯水浴恒溫振蕩器 金壇市岸頭良友實驗儀器廠;UV－3200紫外－可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

準確稱取5份切碎的米棗果肉樣品各5g置于100mL錐形瓶中，加入一定量的乙醇溶液，采用不同提取處理方式提取一定時間，不同溫度下以不同提取速率振蕩提取不同時間，過濾取濾液定容100mL，測定總黃酮和多酚量。

1.2.1 單因素實驗 考察單因素實驗條件提取處理方式(①直接振蕩 6min、②超聲波 6min、③微波6min、④超聲波3min+微波3min、⑤微波3min+超聲波 3min)、料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶8)、乙醇濃度(0%、20%、40%、60%、80%、100%)、振蕩溫度(25、40、50、60、70、80℃)、振蕩時間(0、1、2、3、4、5h)、振蕩速率(0、60、120、180、240、300r/min)、振蕩次數(1、2、3、4 次)對米棗多酚、總黃酮提取的影響［13－15］。

研究一個單因素，其他因素固定，分別為:準確稱取5份切碎的米棗果肉樣品各5g置于100mL錐形瓶中，加入30mL 80%的乙醇溶液，超聲波振蕩提取6min，在50℃下以180r/min振蕩提取2h，過濾取濾液定容100mL，測定總黃酮和多酚量。

1.2.2 回歸正交實驗 根據單因素實驗結果分析，選擇對米棗總黃酮、多酚提取影響較大的料液比、乙醇提取液體積分數和振蕩提取溫度三個因素設計三因素二次回歸正交組合實驗［16－17］，依據考察因素和零水平實驗次數確定星號臂值r為1.414，其水平編碼表如表1所示［18］，其中將料液比換算成乙醇體積。根據實驗結果從而確定米棗中多酚、總黃酮提取的最佳工藝條件。

1.2.3 總黃酮含量的測定［19］

1.2.3.1 蘆丁標準曲線的繪制［20］精確稱取105℃常壓干燥至質量恒定的蘆丁標準品配制成165mg/L的標準溶液，分別取 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL標準溶液于10mL比色管中，并用30%乙醇液定容于5.0mL，0.30mL 5%NaNO2溶液，振蕩均勻靜置5min，再加入0.30mL 10%Al(NO3)3溶液，搖勻后放置6min，再加入4.0mL 1.00mol/L NaOH溶液后用30%乙醇溶液定容至刻度，混勻避光靜置 10min，于510nm波長測定吸光值，以蘆丁量為橫坐標(mg/L)，吸光值為縱坐標(A)，制定標準曲線。

表1 三因素二次回歸正交組合設計水平取值及編碼表Table 1 Levels value and code tables of 3 factors quadratic regressive orthogonal design

1.2.3.2 樣品總黃酮量的測定 準確移取10.0mL提取液定容于100mL容量瓶中，取1.0mL定容液于10mL比色管中，按1.2.3.1方法操作，根據標準曲線查找值X，樣品提取液中總黃酮含量(mg/L)按公式C(mg/L)=X×10mL/1mL計算。

1.2.4 多酚含量的測定［21］

1.2.4.1 沒食子酸標曲曲線的繪制［22］精確稱取105℃常壓干燥至質量恒定的沒食子酸標品配制成0.5mg/L 的標準溶液，分別移取0、1、2、5、10、20mL 標準溶液于含有60mL水的容量瓶中，加入 Folin－Cioealteu試劑 1.00mL，15.00mL 20%Na2CO3溶液，定容于刻度，避光1h后在700nm波長測定吸光值。以沒食子酸為橫坐標(mg/L)，吸光值為縱坐標(A)，制定標準曲線。

1.2.4.2 樣品多酚量的測定 準確移取1.00mL提取液于含有60mL水的容量瓶中后，按1.2.4.1方法操作，樣品提取液中多酚含量(mg/L)在標準曲線中查找計算。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

2.1.1 蘆丁標曲曲線繪制 按照1.2.3的方法繪制出的標準曲線如圖1所示，得回歸方程為:Y=0.0102X+0.0091(R2=0.9978)。從圖1中可以看出，蘆丁濃度在0～50mg/L范圍內與吸光度線性良好。

2.1.2 沒食子酸標曲曲線繪制 按照1.2.4的方法繪制出的標曲曲線如圖2所示，得回歸方程:Y=0.0642X+0.0127(R2=0.9988)，從圖2中可以看出，沒食子酸濃度在0～10mg/L范圍內與吸光度線性良好。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

圖2 沒食子酸的標準曲線Fig.2 The standard curve of gallic acid

2.2 提取處理方式的選擇

通過不同的5種處理方式后，提取液中總黃酮和多酚含量如圖3所示。從圖3可知，用超聲波、微波或兩者結合處理，均高于直接振蕩處理，其中僅只用微波、超聲波處理方式對總黃酮和多酚的含量的影響相差不大。這是因為利用超聲波可以加速米棗中有效成分進入溶劑，節約溶劑;微波的高頻電磁波穿透提取介質，可縮短提取米棗組分中黃酮和多酚等分子的擴散時間，從而提高提取率，縮短提取時間，并且可免去了因高溫對總黃酮和多酚活性成分結構的影響。先微波后超聲波可能會使微波提取出的物質因超聲波聲波震動反而進入溶劑中，米棗中其他物質溶于提取液中，使提取液中總黃酮和多酚量減少。從圖3中可得出處理方式④比其他處理方式所得的總黃酮、多酚含量均要高，即超聲波、微波各處理3min，得到提取液中總黃酮為182.85mg/L，多酚為7.46mg/L，因此選用先3min超聲波處理后3min微波處理較宜。

2.3 料液比的選擇

料液比對總黃酮和多酚量提取結果的影響如圖4所示。從圖4中可知，隨提取液體積的增加，總黃酮、多酚量增大，這是因為料液比高時，導致樣品過飽和現象，從而提取液中總黃酮和多酚量降低;料液比減小，溶劑量的增加提高了米棗與溶劑間黃酮類化合物和多酚類化合物的濃度差，從而減少了米棗中黃酮類和多酚類物質的殘留量，因此可提高提取液中總黃酮和多酚量;但低于1∶4時，提取液中總黃酮不發生變化，多酚含量隨著液體的增大而減少?？紤]成本和提取效果等因素，選擇料液比為1∶4，此時總黃酮和多酚的含量較高，分別為173.84mg/L和8.36mg/L。

圖3 處理方式對米棗中總黃酮和多酚含量的影響Fig.3 Effect of treatment methods on the content of total flavonoids and polyphenols from‘MiZao’jujube

圖4 料液比對米棗中總黃酮和多酚含量的影響Fig.4 Effect of solid－to－liquid ratio on the content of total flavonoids and polyphenols from‘MiZao’jujube

2.4 乙醇提取液濃度的選擇

乙醇提取濃度對總黃酮和多酚量提取結果的影響如圖5所示。由圖5可知，乙醇有機溶劑均比水作為提取液提取的量高，其中總黃酮和多酚的含量先隨乙醇濃度的增加而增多，這是因為乙醇的極性小于水，隨著乙醇濃度的升高，提取液的極性減小，這就有利于極性小的黃酮類和多酚類物質的溶出;當超過60%濃度時，兩者的提取含量反而降低，但總黃酮比多酚降低的速率要快，可能由于提取液的極性與總黃酮的極性相似程度降低所導致，產生很大的滲透壓，影響黃酮類化合物的提取量;提取液濃度過大，提取液顏色加深，說明各種雜質的溶出液增多。因此綜合考慮成本和提取量，選擇乙醇濃度為60%時，提取液中總黃酮和多酚含量較高，總黃酮為238.61mg/L，多酚為 7.56mg/L。

2.5 提取振蕩溫度的選擇

不同振蕩溫度對總黃酮和多酚量的影響如圖6所示。由圖6可知，提取液中總黃酮、多酚含量先隨溫度的升高而增大，這是因為提高溫度，分子熱運動加快，有利于總黃酮和多酚的浸出;超過60℃時，黃酮類化合物的提取除了溶劑效應外，還伴隨著熱效應的影響，故隨溫度的升高總黃酮的含量減少，超過70℃，提取液中總黃酮的含量反而增大，可能是因為溫度過高，溶劑沸騰破壞細胞，使細胞中的其他物質溶出于提取液中，提取液中雜質增加而吸光度增大所致;由于多酚中含有大量的酚羥基，性質非?；顫?，溫度過高時不穩定，往往發生一些不可逆的化學反應，如氧化、縮合等，所以多酚在超過60℃時提取量減小;綜合考慮，提取振蕩溫度應選擇50℃，此時總黃酮為240.75mg/L，多酚為8.17mg/L。

圖5 乙醇濃度對米棗中總黃酮和多酚含量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the content of total flavonoids and polyphenols from“MiZao”jujube

圖6 振蕩溫度對米棗中總黃酮和多酚含量的影響Fig.6 Effect of oscillation temperature on the content of total flavonoids and polyphenols from‘MiZao’jujube

2.6 提取振蕩時間的選擇

振蕩時間對總黃酮和多酚量提取的影響如圖7所示。由圖7可知，隨著振蕩時間的延長，提取液中的總黃酮、多酚量先增高，然后趨于平衡;總黃酮量在提取時間超過2h后，基本沒有什么變化，多酚在超過3h后基本沒有明顯變化，超過4h后多酚量減少，可能由于時間過長而導致部分發生了降解、縮合和氧化等化學反應。因此總黃酮比多酚更穩定些，米棗汁提取過程中盡量減少提取時間以免多酚活性的損失。綜合考慮時間和簡化操作結合總黃酮、多酚量兩個指標，選擇振蕩提取2h較合理，此時得到總黃酮、多酚的量分別為229.58mg/L和7.66mg/L。

2.7 提取振蕩速率的選擇

振蕩速率對總黃酮和多酚量提取的影響如圖8所示。由圖8可知，提取時提取液中多酚、總黃酮量振蕩均比未振蕩高;隨著振蕩速率的增大，提取液中總黃酮、多酚量均增大，是因為振蕩有利于溶劑與米棗果肉充分接觸，加快米棗中總黃酮和多酚的溶出;當溶出速度達到一定值時，提取量不再隨振蕩速率的增加而增大?？傸S酮在振蕩速率超過180r/min時，趨于平衡;多酚在120～240r/min時，變化較小，在180r/min時，含量最大。由于米棗中總黃酮類物質比多酚物質含量高，多酚達到最大溶出速率所需振蕩速率較小。綜合考慮速率對總黃酮、多酚的影響，選擇振蕩速率為180r/min，此條件下提取總黃酮、多酚量分別為226.37mg/L和8.39mg/L。

圖7 振蕩時間對米棗中總黃酮和多酚含量的影響Fig.7 Effect of oscillation time on the content of total flavonoids and polyphenols from‘MiZao’jujube

圖8 振蕩速率對米棗中總黃酮和多酚含量的影響Fig.8 Effect of oscillation speed on the content of total flavonoids and polyphenols from‘MiZao’jujube

2.8 提取次數的選擇

提取次數對總黃酮和多酚量的影響如圖9所示。由圖9可知，提取液中總黃酮和多酚量均隨提取次數的增加而減少，但是提取液的體積均比前次體積大，體積分別為 100、200、300、400mL，將提取液的體積均換算成100mL，總黃酮和多酚量結果如圖9，隨著提取次數的增加，總黃酮、多酚的含量增大，當提取次數超過2次時，總黃酮、多酚的含量雖然有增加的趨勢，但卻是不太明顯?？紤]操作時間和節約成本，防止多酚的多次提取導致降解、縮合和氧化等不良化學反應，本實驗選擇提取次數為2次，此時米棗中總黃酮和多酚基本已浸提出，總黃酮和多酚含量分別為216.30mg/L和8.52mg/L。

圖9 換算為100mL米棗提取液后總黃酮和多酚含量Fig.9 Contents of total flavonoids and polyphenols after the 100mL‘MiZao’jujube extract conversion

表2 二次回歸正交組合設計正交表及結果Table 2 Orthogonal regression design and corresponding experimental results

2.9 最佳條件工藝的選擇

依據二次回歸正交組合實驗設計方法以及因素水平編碼表 1，實驗設計表［23－24］及其結果如表 2。

對總黃酮提取優化方差分析見表3，總黃酮失擬項極不顯著，總的回歸關系達到極顯著水平，說明回歸方程擬合的較好。除X1X3、X2X3外，各項系數水平達到顯著或極顯著水平。雖然X2X3在0.05水平上不顯著，但在0.25水平上是顯著的，故不予剔除。所建立的回歸方程為:

利用 Excel可求得 X1=1.414，X2=1.414，X3=－0.688，解得 y有極大值，根據 X1=，X2=，X3=可以求出在提取溫度為60℃，提取乙醇濃度為80%，料液比為1∶5.03效果最好，但考慮操作料液比更正為1∶5，在此條件下提取液中總黃酮量預測值為245.93mg/L。

對多酚提取優化方差分析見表4，多酚失擬性極不顯著，總的回歸關系達到顯著水平，說明回歸方程擬合的較好。除X1X2和X1X3以外，其他變異系數達到極顯著水平或顯著水平。但X1X3在0.25水平上是顯著的，故不予剔除。所建立的回歸方程為:

利用 Excel可求得當 X1=1.414，X2=0.461，X3=－1.414，解得 y 有極大值，根據 X1=，X2=，X3=可以求出在提取溫度為60℃，提取乙醇濃度為66.52%，料液比為1∶4效果最好。在此條件下提取液中多酚量預測值為9.16mg/L。

表3 總黃酮提取工藝回歸正交實驗方差分析表Table 3 Variance analysis of regression orthogonal experiment results of total flavonoids extraction

2.10 驗證實驗

2.1 0.1 總黃酮提取驗證實驗 根據單因素和回歸正交實驗，總黃酮提取條件為用80%乙醇、料液比1∶5，超聲波和微波各處理3min、振蕩溫度60℃、振蕩速率180r/min、提取2次、每次振蕩2h，在此條件下，驗證建立的最優數學模型，測得提取液中總黃酮的提取量為246.14mg/L，與理論預測值偏差0.085%，比實驗組的值高，結果表明方程預測性很好，與實際的偏差較小。

表4 多酚提取工藝回歸正交實驗方差分析表Table 4 Variance analysis of regression orthogonal experiment results of polyphenols extraction

2.1 0.2 多酚提取驗證實驗 根據單因素和回歸正交實驗，總黃酮提取條件為用66.52%乙醇、料液比1∶4，超聲波和微波各處理3min、振蕩溫度60℃、振蕩速率180r/min、提取2次、每次振蕩2h，在此條件下，驗證建立的最優數學模型，測得提取液中多酚量為8.92mg/L，與理論預測值偏差－2.51%，但比實驗組的值高，結果表明方程預測性很好，與實際的偏差較小。

3 結論

3.1 在單因素實驗的基礎上，使用回歸正交設計建立了數學模型并進行規劃求解，得到米棗中總黃酮、多酚提取的最佳優化工藝條件。對同一提取液中同時測定總黃酮、多酚量的結果表明提取工藝中乙醇濃度、料液比和振蕩溫度對其提取影響較大。

3.2 提取總黃酮的最佳工藝條件為:80%乙醇、料液比1∶5，超聲波和微波各處理3min、振蕩溫度60℃、振蕩速率180r/min、提取2次、每次振蕩2h，得到提取液中總黃酮量為246.14mg/L。

3.3 提取多酚的最佳工藝條件為:66.52%乙醇、料液比1∶4，超聲波和微波各處理3min、振蕩溫度60℃、振蕩速率180r/min、提取2次、每次振蕩2h，得到提取液中多酚量為8.92mg/L。

［1］趙愛玲，李登科，王永康，等.棗品種資源的營養特性評價與種質篩選［J］.植物遺傳資源學報，2010，11(6):811－816.

［2］陳施丞，王小珊，羅琦，等.市場經濟中的農產品品牌—“嶄山米棗”實地考察案［J］.經濟管理者，2010，20:78.

［3］王作周.四川三臺:打造中國米棗之鄉［N］.科技日報，2007－12－18(12).

［4］王大鵬，蒲有能，秦文，等.不同保鮮劑對米棗采后貯藏品質的影響［J］.食品科學，2012，33(10):301－305.

［5］郭松年.石榴汁花色苷穩定性、抗氧化性及其組分鑒定［D］.楊凌:西北農林科技大學，2008.

［6］李安文.藍莓花色苷穩定性及分離純化技術研究［D］.長沙:湖南農業大學，2011.

［7］胡迎芬.冬棗黃酮的提取分離及抗氧化、抑瘤活性研究［D］.青島:青島大學，2009.

［8］王雅.沙棗果實可食部分活性物質提取及抗氧化、抗腫瘤作用研究［D］.楊凌:西北農林科技大學，2012.

［9］好會芳.棗果中多酚類物質的提取工藝及體外抗氧化作用研究［D］.保定:河北農業大學，2005.

［10］Ana Bucic'－Kojic'，Mirela Planinic'，Srec'ko Tomas，et al.Study of solid－liquid extraction kinetics of total polyphenols from grape seeds［J］.Journal of Food Engineering，2007，81:236－242.

［11］Boonyadist Vongsak，Pongtip Sithisarn，Supachoke Mangmool，et al.Maximizing total phenolics，total flavonoids contents and antioxidant activity of Moringa oleifera leaf extract by the appropriate extraction method［J］.Industrial Crops and Products，2013，44:566－571.

［12］Songyi Lin，Liyan Wang，Gregory Jones，et al.Optimized extraction of calcium malate from eggshell treated by PEF and an absorption assessment in vitro［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2012，50:1327－1333.

［13］張吉祥，歐來良.正交實驗法優化超聲提取棗核總黃酮［J］.食品科學，2012，33(4):18－23.

［14］劉春花，高金鋒，王鵬科，等.超聲波法提取苦蕎黃酮的工藝研究［J］.西北農業學報，2009，18(1):281－284.

［15］Fausto Gironi，Vincenzo Piemonte.Temperature and solvent effects on polyphenol extraction process from chestnut tree wood［J］.Chemical Engineering Research and Design，2011(89):857－862.

［16］王曉紅.農產品安全中的質量控制研究［D］.青島:青島大學，2008.

［17］戰峰，邵婧，韓泳平.回歸正交設計優化核桃殼棕色素的提取工藝［J］.食品科學，2011，32(16):196－200.

［18］李運雁，胡傳榮.實驗設計獎與數據處理［M］.北京:化學工業出版社，2008:184－195.

［19］XiQian LIU，Zhen Guo，YiWei QING.Study on solvent sublation for separation and enrichment of total flavonoids in S.medusa.Maxim ［J］.Procedia Engineering，2011(18):184－187.

［20］崔瑋，李玉蘭，楊愛梅.超聲輔助提取甘青虎耳草總黃酮工藝及其抑菌作用［J］.食品科學，2012，33(12):108－113.

［21］董蕊，叢海迪，鄭毅男.單花蜂蜜多酚類物質的抗氧化活性［J］.食品科學，2012，33(11):94－98.

［22］Yinping Li，George K Skouroumounis，Gordon M Elsey，et al.Microwave－assistance provides very rapid and efficient extraction of grape seed polyphenols［J］.Food Chemistry，2011，129:570－576.

［23］巨敏，楊鵬，朱沛沛，等.二次回歸正交優化枸杞中總黃酮提取工藝的研究［J］.中國釀造，2011(10):92－96.

［24］Allan McQuarrie，Chih－ Ling Tsai.Model selection in orthogonal regression［J］.Statistics ＆ Probability Letters，1999，45:341－349.