納他霉素-羥丙基-β-環糊精包合物的抗菌活性及穩定性研究

王 燕，毛 勇，李 飛，張志敏，張美麗，鄧 媛

(陜西省微生物研究所，陜西西安710043)

納他霉素(Natamycin)也稱游鏈霉素、匹馬菌素(Pimaricin)或海松素［1］，是一種多烯烴大環內酯類的抗真菌物質，對各種霉菌和酵母菌有高度抑制能力。納他霉素因其很難被人畜的消化道吸收，目前研究表明它對人畜無致癌、致畸和致敏等有害作用［2］，所以作為一種天然的生物防腐劑已被批準用于某些乳制品、肉類、飲料、水果等許多食品的生產和保藏之中［3］。但是由于納他霉素水溶性非常低(30～50mg/L)且不穩定，造成納他霉素的生物利用度很低，成為它在行業中應用的限制因素，影響了其制劑的開發［4］。環糊精(cyclodextrin，簡稱CD)是由環狀糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)作用于淀粉得到的由6、7、8…個吡喃葡萄糖單元以α－1，4鍵連接的環狀低聚糖，結構外形為“圓錐狀花環”，空腔內部為疏水性空間，外部兩側為親水區域，能夠包合許多天然和人工合成的化合物分子，增加客體分子的穩定性和溶解性［4－5］。其衍生物羥丙基－β－環糊精(HP－β－CD)，可破壞環糊精分子內氫鍵，在保持環糊精空腔的同時又克服了環糊精分子低水溶性的缺點，顯著提高客體分子的水溶性［6］。蘇柘僮等人［7］研究表明，膽酸經 HP－β－CD包合后，溶解度增加11.81倍。魏海濤等人［8］研究表明，氟苯尼考－β－環糊精包合物在水中的溶解度平均約為氟苯尼考原藥的5.78倍。國外學者John L Koont Z等人［9］研究顯示，經 HP－β－CD 包合后納他霉素的溶解度增加了約152倍。國內學者熊偉等人［10］研究顯示，經 HP－β－CD 包合后納他霉素的溶解度增加了約200多倍。本研究是以HP－β－CD包合后的納他霉素為材料，首先測定了包合物中納他霉素在水溶液中的溶解度，然后對包合后納他霉素的抗菌活性及生物穩定性進行研究，以期獲得溶解度高、抗菌活性好且穩定性強的納他霉素，為納他霉素的防腐應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納他霉素－HP－β－CD包合物 實驗室自制;納他霉素(純度90%)安泰生物科技有限公司;孟加拉紅瓊脂培養基 北京陸橋生物科技有限公司生產，批號為:1110182;HP－β－CD(含量98%)西安立德生物藥物科技有限公司;酵母菌2.394(Saccharomycescerevisiae)、白色念珠菌 2.2086(candida Albicans)、繩狀青霉 3.3872(Penicillium funiculosum)、黃曲霉3.3950(Aspergillus flavus)、黑曲霉 3.5387(Aspergillusniger)、米 曲 霉 3.2924(Aspergillusoryzae)、米 根 霉 3.2686(Rhizopus oryzae)、綠色木霉 3.2941(Trichoderma viride)，鐮刀菌3.2835(Fusarium)由陜西省微生物所菌種保藏中心提供。

TU1901紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;ZHWY－211C恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;MJX－160/250C霉菌培養箱上海博訊實業有限公司醫療設備廠;GXZ智能光照培養箱 寧波東南儀器有限公司;GH－600ASB隔水培養箱 北京科偉永興儀器有限公司;PHSJ－4A型實驗室PH計 上海精密科學儀器有限公司;強云牌ZSZ石英紫外線殺菌燈 北京強云特種燈泡廠;二孔A電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;BS224S電子精密天平 德國塞多利斯。

1.2 實驗方法

1.2.1 納他霉素的含量測定

1.2.1.1 測定波長選擇 取適量納他霉素，加甲醇溶解，配制成一定的濃度，另取適量的羥丙基－β－環糊精用甲醇溶解配成溶液，分別用紫外分光光度計在200～400nm范圍內進行掃描。尋找納他霉素的最大吸收峰并確保羥丙基－β－環糊精在此處無吸收，以確定實驗最佳檢測波長。

1.2.1.2 標準曲線的繪制 精密稱取1.0mg納他霉素對照品，加入到100mL的容量瓶中，用蒸餾水定容到100mL，配制成10mg/L的納他霉素標準品水溶液，標記為母液。將母液作相應稀釋，依次配制成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/L 的納他霉素標準品水溶液，在最佳波長處測定吸收度，以吸收度(A)對質量濃度(C)進行線性回歸，得出線性回歸方程。

1.2.1.3 納他霉素含量的測定 將包合物和對照品做相應稀釋后，在紫外分光光度計最佳波長處測定吸收度，利用線性回歸方程，計算得出包合物和對照品中納他霉素的含量。

1.2.2 溶解度測定 采用平衡法:分別將過量包合物和對照品加入溶劑中，25℃的恒溫振蕩儀，以150r/min速率進行平衡溶解，經0.45μm孔徑濾膜過濾后取上清液測定303nm處吸收度，平行測量三次，取平均值。

1.2.3 包合物的抑菌性研究 此次實驗采用瓊脂稀釋法測定在1×105cfu/mL菌液濃度下包合物和對照品的最低抑菌濃度(MIC)。通過觀察平板上實驗菌株的生長情況，以無菌生長的濃度為MIC，表明藥物對實驗菌株有抑制作用，單一菌落生長的可忽略不計。

將納他霉素有效含量為40mg/kg的包合物溶液和對照溶液各取不同的量加入到滅菌冷卻至45℃的定量孟加拉紅瓊脂培養基中，混合均勻，傾注平板，每個濃度傾注兩個平皿。待其凝固后即為含不同納他霉素濃度的培養基。分別接種1×105cfu/mL各菌液0.1mL，涂布，28℃培養72h，觀察待測菌的生長情況。

1.2.4 納他霉素包合物穩定性實驗

1.2.4.1 紫外照射對包合物中納他霉素穩定性的影響 將包合物和對照品分別處理配制成含相同適宜濃度的納他霉素的水溶液，各取20mL置于無菌平皿內，同時放置在紫外光照強度20W，距離30cm處照射0、15、30、45、60、75、90min，以不處理的樣品為空白對照，根據1.2.1方法測定納他霉素相對含量。每組數據測量三次取平均值。

納他霉素相對含量(%)=A303(納他霉素測定)/A303(納他霉素初始)×100

1.2.4.2 光照對包合物中納他霉素穩定性的影響將包合物和對照品分別處理配制成含相同適宜濃度的納他霉素的水溶液，分別取20mL加入到具塞的石英試管中，同時放置在光照培養箱(4500LX)中照射0、2、4、6、8、10d，以不處理的樣品為空白對照，根據1.2.1方法測定納他霉素相對含量。每組數據測量三次取平均值。

1.2.4.3 溫度對包合物中納他霉素穩定性的影響將包合物和對照品分別處理配制成含相同適宜濃度的納他霉素的水溶液，分別平均分為5份，每份20mL，分別置于50、80、100、120℃條件下處理 0、30、60、90、120min，以未進行溫度處理的樣品做為空白對照，根據1.2.1方法測定納他霉素相對含量。每組數據測量三次取平均值。

1.2.4.4 氧化劑對包合物中納他霉素穩定性影響將包合物和對照品分別處理配制成含相同適宜濃度的納他霉素的水溶液，分別加入1%雙氧水攪拌均勻作用 0、15、30、45、60、75、90min，以不加入雙氧水的樣品為空白對照，根據1.2.1方法測定納他霉素相對含量。每組數據測量三次取平均值。

1.2.4.5 pH對包合物中納他霉素穩定性影響 將包合物和對照品分別處理配制成含相同適宜濃度的納他霉素的水溶液，分別平分9份，每份20mL，分別調pH 為 2、3、4、5、6、7、8、9、10，靜置 1h，以不處理的樣品為空白對照，根據1.2.1方法測定納他霉素相對含量。每組數據測量三次取平均值。

2 結果與分析

2.1 檢測波長與標準曲線的確定

據1.2.1.1結果顯示納他霉素在303nm處有最大吸收峰，而羥丙基－β－環糊精在此處無吸收，故選303nm為最佳檢測波長。據1.2.1.2結果顯示回歸方程為 A=0.1727C－0.0012，r2=0.9995，表明納他霉素吸收度與質量濃度在2.0～10.0mg/L內呈良好的線性關系。

2.2 包合物中納他霉素的水溶度

由表1可知:包合物中納他霉素的最大水溶度為61.58×103mg/L，是同等條件下對照品最大水溶度(34.37mg/L)的1792倍。實驗結果證明:羥丙基－β－環糊精的包合能大幅度提高納他霉素的水溶度。

表1 包合物中納他霉素的水溶度Table 1 The water solubility of natamycin in the inclusion complex

2.3 包合物的最小抑菌濃度(MIC)

由表2可知:在1×105cfu/mL菌液濃度下，包合物和對照品對8種常見真菌的MIC值完全相同。二者對黃曲霉的MIC值略有不同:包合物的MIC值為5mg/kg，而對照的MIC值為6mg/kg，說明包合物對黃曲霉的抑菌效果強于對照品。實驗結果證明:經羥丙基－β－環糊精包合后的納他霉素，其原本的抑菌能力沒有減弱。

表2 包合物的最小抑菌濃度值(MIC)Table 2 The MIC of the inclusion complex

2.4 紫外照射對包合物中納他霉素穩定性的影響

由表3可知:紫外線照射(強度20W，距離30cm處)90min對包合物和對照品中的納他霉素相對含量影響較大:包合物中納他霉素的相對含量由100%降低到61.90%，損失率為38.1%;對照品中納他霉素的相對含量由100%降低到31.05%，損失率為68.95%。但是在紫外處理15～90min的整個過程中，包合物中納他霉素相對含量值始終高于對照品。這是由于納他霉素在紫外光下分解，失去其中的四烯結構所致穩定性變差，而羥丙基－β－環糊精的包合，增加了納他霉素對紫外線的穩定性。

2.5 光照對包合物中納他霉素穩定性的影響

由表4可知:光照(4500LX)處理10d對包合物和對照品中納他霉素相對含量影響較大:包合物中納他霉素的相對含量由100%降低到46.59%，損失率為53.41%;對照品中納他霉素的相對含量由100%降低到34.56%，損失率為65.44%。但是在日光處理2～10d的整個過程中，包合物中納他霉素相對含量均高于對照品。這是由于在納他霉素的分子結構中，含有共軛不飽和的碳雙鍵，容易自氧化，光照在一定程度上促進了這種氧化作用。而羥丙基－β－環糊精的包合，增加了納他霉素對光照的穩定性。

2.6 溫度對包合物中納他霉素穩定性的影響

由表5 可知:當溫度 50、80、100、120℃處理 30～90min時，包合物與對照品中納他霉素相對含量均較高(大于80%);當120℃處理120min后，對照品中納他霉素的相對含量降低到80%以下，而包合物中納他霉素的相對含量仍高于80%。但是在整個處理過程中，包合物中納他霉素相對含量始終高于對照品。這是由于納他霉素具有一定的抗熱處理能力，能耐受短暫高溫，而羥丙基－β－環糊精的包合，增加了納他霉素在較高溫度環境中的穩定性。

2.7 氧化劑對包合物中納他霉素穩定性的影響

由表6可知:1%雙氧水處理90min，對包合物和對照品中納他霉素相對含量影響較明顯:包合物中納他霉素的相對含量由100%降低到36.03%，損失率為63.97%;對照品中納他霉素的相對含量由100%降低到35.79%，損失率為64.21%。但是在1%雙氧水處理15～90min的整個過程中，包合物中納他霉素相對含量始終高于對照品。可見羥丙基－β－環糊精的包合，在一定程度上增加了納他霉素對1%雙氧水的穩定性。

表3 紫外線照射對包合物中納他霉素穩定性的影響Table 3 Effect of ultraviolet light to natamycin’s stability in the inclusion complex

表4 光照對包合物中納他霉素穩定性的影響Table 4 Effect of fluorescent lamp to natamycin’s stability in the inclusion complex

表5 溫度對包合物中納他霉素液穩定性的影響Table 5 Effect of temperature to natamycin’s stability in the inclusion complex

表6 1%雙氧水對包合物中納他霉素穩定性的影響Table 6 Effect of hydrogen peroxide to natamycin’s stability in the inclusion complex

表7 pH對包合物中納他霉素穩定性影響Table 7 Effect of pH to natamycin’s stability in the inclusion complex

2.8 pH對包合物中納他霉素穩定性的影響

由表7可知:在pH4～9的范圍內，包合物和對照品的抑菌活性殘留率均較高(大于80%);在pH＜4和pH＞9時，pH對包合物和對照品的抑菌活性殘留率影響均較大。但在整個pH2～10的范圍內，包合物中納他霉素的相對含量始終高于對照品。因為強酸強堿容易使納他霉素分子結構中的共軛的不飽和雙鍵降解，但是羥丙基－β－環糊精包合后，會使納他霉素的穩定性有所提高。

3 結論與討論

3.1 納他霉素應用中存在的問題

納他霉素作為一種抗真菌劑在醫療、青儲飼料、糧儲、家禽養殖等方面有較好的抗菌效果，特別是在食品原料保鮮、成品防腐方面的應用顯示了良好的前景［11］。但是由于低水溶性的缺點，嚴重地制約了納他霉素更廣泛的開發利用。近幾年各國學者對難溶分子主要通過生物轉化法，在分子骨架上添加極性基團，如膽酸鹽［12］、改性多糖［13－15］，直接達到增溶的目的［16］。但其結果總是存在一定的缺陷:或者會顯示出較低的生物活性、或者會降低生物穩定性有的甚至還會產生毒性。

3.2 羥丙基－β－環糊精的增溶效果

環糊精(CD)由于外緣親水而內腔疏水，它能夠像酶一樣提供一個疏水的結合部位，作為主體包絡各種適當的客體，從而有效地增加一些水溶性不良的分子在水中的溶解度和溶解速度。環糊精有多種同系物，目前應用最廣泛的是 β－環糊精。羥丙基－β－環糊精是β－環糊精的衍生物之一，對許多化合物具有良好的包合作用，不僅能提高被包合物的水溶性，而且具有在生物體內提高被包絡藥物的釋放速度和生物穩定性的作用。

3.3 納他霉素－羥丙基－β－環糊包合物的優良性能

3.3.1 增加了納他霉素的水溶性 包合物中納他霉素最大水溶度為61.58×103mg/L，對照品的最大水溶度為34.37mg/L，前者的溶解度是后者的1792倍。羥丙基－β－環糊精的包合，極大地提高了納他霉素的水溶性。

3.3.2 提高了納他霉素的生物穩定性 經過紫外線照射15～90min、光照處理 2～10d、溫度(50、80、100、120℃)處理 30～120min、1%的雙氧水處理 15～90min或在pH2～10條件下作用1h后，包合物中納他霉素的相對含量與對照品相比均有增高的趨勢。羥丙基－β－環糊精的包合，提高了納他霉素的生物穩定性。

3.3.3 保持了納他霉素良好的抗菌性 在1×105cfu/mL菌液濃度下，包合物和對照品對8種常見真菌的MIC值完全相同，且包合物對黃曲霉的抑菌效果要優于對照品。羥丙基－β－環糊精的包合，使納他霉素保持了良好的抗菌性。

可見納他霉素－羥丙基－β－環糊包合物，不僅能大幅提高納他霉素的水溶性，還能提高其生物穩定性，同時又不降低其抗菌活性，為日后納他霉素－羥丙基－β－環糊包合物的工業化生產提供理論基礎并且為納他霉素的應用提供了更多的空間。

［1］趙宏陽.多烯類抗菌劑納他霉素［J］.河北化工，2009，32(7):47－48.

［2］尤新.功能性發酵制品［M］.北京:中國輕工業出版社，2000:350－361.

［3］Davidson P M，Doan C H.Natamycin Antimicrobials in Foods［M］.New York，Basel and Hongkong:Marcel Dekker Inc，1993:395－407.

［4］高玉榮，王雪萍.天然抗真菌食品生物防腐劑－納他霉素的性質及在食品中的應用［J］.農產品加工，2009(5):7－9.

［5］Martin M，Del V.Cyclodextrins and their uses a review［J］.Proess Biochem，2004(39):1033－1046.

［6］陶濤.羥丙基倍他環糊精的特性及其藥劑學應用［J］.中國醫藥工業雜志，2002，33(6):304－306.

［7］蘇柘僮，楊明，吳品江，等.膽酸－羥丙基－β－環糊精包合物的制備工藝及相溶解度研究［J］.中成藥，2009，31(3):380－382.

［8］魏海濤，宋敏，李亮華，等.氟苯尼考－β－環糊精包合物的研制［J］.華南農業大學學報，2009，30(4):94－97.

［9］John L，Koontz，Joseph E，et al.Formation of natamycin:cyclodextrin inclusion complexes and their characterization ［J］.Agric Food Chem，2003(51):7106－7110.

［10］熊偉，揚放，李薔薇，等.2－羥丙基－β－環糊精對納他霉素的增溶作用［J］.中國抗生素雜志，2009，34(5):53－55.

［11］岳昊博，岳喜慶，李靖，等.納他霉素(Natamycin)的特性、應用及生產和研究狀況［J］.食品科技，2007(3):162－166.

［12］張瓊，李林，魏東芝，等.膽酸鹽/脂類混合膠束對疏水性姜黃素的增溶性能［J］.華東理工大學學報，2010，36(5):639－644.

［13］王亞南，王洪權.2－羥丙基－β－環糊精對抓諾昔康的增溶作用［J］.解放軍藥學學報，2006，22(2):147－148.

［14］王茹林，楊郁，雙少敏，等.β－環糊精衍生物對黃酮類藥物的增溶作用［J］.應用化學，2002(1):702－704.

［15］陳圓圓，劉佳佳，唐課文，等.羥丙基－β－環糊精對萘普生的增溶及穩定性作用［J］.光譜實驗室，2007，24(4):632－636.

［16］方繼前，郭亞軍，謝練武.生物轉化法定向結構改造難溶性藥物［J］.現代化工，2010，30(8):32－36.