人SUMO病毒載體構建及穩轉神經母細胞瘤SHSY5Y細胞系的建立

常 晶，陸 菡，薛慶生，于布為

(上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院，上海 200025)

小泛素化相關修飾蛋白(SUMO)是一種新的類泛素家族成員，SUMO化介導的蛋白翻譯后修飾是調控神經元功能的重要機制［1～3］。脊椎動物SUMO家族有SUMO1～4四個成員，除SUMO4僅在腎、淋巴結、脾臟表達外［4，5］，SUMO1 ～3 均在神經系統及其他系統內廣泛表達。SHSY5Y細胞系屬人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞系的一個亞類，不僅形態類似神經元，在功能方面也表現出活體神經元的特點［6］。2012年9～11月，我們將具有嘌呤霉素抗性的逆轉錄病毒載體與皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(pVSVG)及HIV的gag-pol基因共轉染293T細胞，形成高滴度的逆轉錄病毒，感染SHSY5Y細胞以構建表達SUMO的穩轉細胞系，旨在為進一步研究SUMO在中樞神經系統中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人神經母細胞瘤SHSY5Y細胞(低分化)購于美國典型培養物保藏中心(ATCC)。293T細胞購于中國科學院細胞庫。pcDNA3.0-HASUMO1、pcDNA3.0-HA-SUMO2、pcDNA3.0-HA-SUMO3質粒及 pBabe-3×Flag-pruo、pVSVG和 gag-pol質粒均由上海交通大學醫學院細胞信號轉導實驗室程金科教授惠贈。DMEM培養液購自Gibco公司，感受態Top10與DNA凝膠純化試劑盒購自天根科技，限制性內切酶及DNA連接試劑盒均購自Promega公司，反轉錄試劑盒購自Takara公司，轉染試劑 LipofectamineMT2000購自 Invitrogen公司，Flag M2抗體購自Sigma公司。引物合成服務由上海生工生物工程有限公司提供，質粒測序由北京六和華大基因科技公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 pBabe-3 ×Flag-SUMOs-puro的構建 pBabe-3×Flag-puro在pBabe-puro質?；A上改造而來。用EcoRⅠ和 XhoⅠ雙酶切 pcDNA3.0-HA-SUMO1、pcDNA3.0-HA-SUMO2、pcDNA3.0-HA-SUMO3 質粒，用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切pBabe-puro載體，酶切產物經瓊脂糖電泳后，分別回收并純化相應DNA片段。用DNA連接酶將二者酶切產物連接。16℃過夜。連接產物轉化感受態細菌Top10，37℃過夜。酚—氯仿初步篩選后選陽性克隆進行擴增，堿裂解法提取pBabe-3×Flag-SUMOs-puro質粒。

1.2.2 pBabe-3 × Flag-SUMOs-puro 的鑒定 用EcoRⅠ、XhoⅠ和SalⅠ分別單酶切重組表達載體，經1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測片段長度后測序證實。DNA測序鑒定:SUMO1、SUMO2、SUMO3通用上游引物為:5'-CGGGATCCATGTACCCATACGATGTT-3';SUMO1下游引物為:5'-CCGCTCGAGCTAAACTGTTGAATGACC-3';SUMO2下游引物為:5'-CCGCTCGAGTCAGTAGACACCTCCCGT-3';SUMO3下游引物為:5'-CCGCTCGAGCTAGAAACTGTGCCCTGC-3'。

1.2.3 病毒包裝 取處于對數生長期的293T細胞傳代，待細胞達到75%密度時轉染。將測序正確的pBabe-3×Flag-SUMOs-pruo的質粒、pVSVG和 gagpol共同轉染293T細胞，同時設立空載體對照組(MOCK組)。目的質粒、pVSVG和gag-pol的轉染比例為1∶1∶1。48 h后收集逆轉錄病毒上清，經0.45 μm濾器過濾、分裝，-80℃冰箱保存。

1.2.4 pBabe-3 ×Flag-SUMOs-SHSY5Y 穩轉細胞系的建立

1.2.4.1 SHSY5Y 細胞嘌呤霉素最小致死濃度的確定及穩定表達抗性細胞株的篩選 取24孔板接種適量SHSY5Y細胞，待細胞達到75%密度時，加入不同濃度的嘌呤霉素(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL)，每一濃度設3個孔，2 d后根據細胞死亡情況確定嘌呤霉素對SHSY5Y細胞的最小致死濃度。待6孔板中SHSY5Y細胞融合度達75%時，分別加入1.5 mL包裝了3×Flag-SUMO1、3×Flag-SUMO2和3×Flag-SUMO3質粒的病毒上清于37℃、5%CO2培養箱培養24 h后，更換為含6 μg/mL嘌呤霉素的篩選培養基培養，2～3 d換液1次，并重新加入嘌呤霉素。待未加入病毒感染的培養基內SHSY5Y細胞(Mock組)死亡后，有抗性克隆集落長出時繼續加入嘌呤霉素培養。

1.2.4.2 pBabe-3 × Flag-SUMOs-puro 在 SHSY5Y單克隆細胞中的表達測定 采用Western blot法將篩選獲得的pBabe-3×Flag-SUMOs-puro細胞單克隆分別用胰酶消化收集細胞，PBS洗滌后加入2×SDS超聲裂解，4℃、12000 r/min離心20 min，取上清分裝。取適量蛋白稀釋后進行蛋白定量。將各樣品蛋白稀釋至相同濃度，100℃水浴10 min，等量加入10% ～12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，并電轉入PVDF膜中，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入稀釋的抗Flag抗體，室溫孵育1 h，TBST洗3次(5～10 min/次)。二抗(辣根過氧化物酶連接的羊抗鼠抗體)孵育1 h，TBST洗3次(5～10 min/次)。采用FUJIFILM LAS-4000光成像系統進行圖片顯像。

2 結果

2.1 pBabe-3×Flag-SUMOs-puro的鑒定 將構建的pBabe-3×Flag-SUMOs-puro質粒經DNA測序，結果顯示SUMO1、SUMO2、SUMO3及MOCK組的模板均成功構建于pBabe-3×Flag-puro載體上，序列完全正確，與目的序列相同。

2.2 pBabe-3×Flag-SUMOs-puro在 SHSY5Y 細胞中的表達 Western blot結果顯示抗Flag的抗體能檢測到通過病毒轉染的pBabe-3×Flag-SUMOs-puro在SHSY5Y細胞中的表達，由圖1可以看出，病毒轉染pBabe-3×Flag-SUMOs-puro的SHSY5Y細胞中SUMO1、SUMO2、SUMO3的含量明顯多于 MOCK組。同時，只有轉染pBabe-3×Flag-SUMOs-puro的SHSY5Y細胞能被Flag抗體在相應的位置檢測到條帶。見圖1。

圖1 SUMO1、SUMO2、SUMO3 在 SHSY5Y細胞中的表達(Western blot法)

3 討論

SUMO化介導的蛋白翻譯后修飾被認為是調控神經元功能的重要機制。SUMO能可逆地與靶蛋白賴氨酸殘基進行多肽共價修飾，從而調節底物功能［1］。SUMO化修飾廣泛參與了基因轉錄的調控、細胞周期的調控、蛋白翻譯后修飾等過程，在信號轉導、核質運輸、泛素化的拮抗等方面均發揮重要作用。SUMO化修飾的理論基礎為蛋白質學說，其發生與去除都能夠改變蛋白質的功能。除了已經發現的膜蛋白外，SUMO化修飾蛋白大多屬于細胞信號轉導通路，在轉錄因子的轉錄開放過程中發揮著重要作用，最終能夠影響一系列基因的轉錄水平［7］。然而，SUMO體系的許多特點增加了研究的難度，比如修飾水平普遍較低，在生理狀態下存在大量去SUMO化酶系，SUMO相關蛋白復合體系形式多樣，發揮作用的酶和底物種類繁多等［2］。因SUMO修飾水平低，對研究的靈敏度和準確度提出了更高的要求。因此排除諸多干擾因素，對SUMO體系進行確切的分析，就要求建立針對SUMO修飾的特定研究工具，人SUMO穩轉的細胞系即是諸多研究工具中的一種。由于無論在人體內或體外組織細胞中SUMO化的修飾水平均較低，不容易被觀察和檢測到，因此，通過構建SUMO表達的穩轉細胞系來放大SUMO化修飾的變化趨勢，使其易于觀察和檢測就成為研究SUMO這一蛋白翻譯后修飾的首要環節。鑒于常規的脂質體等方法轉染SHSY5Y細胞效率較低，本研究選用逆轉錄病毒作為轉染工具，通過病毒感染穩轉pBabe-3×Flag-SUMOs-puro質粒，使SUMO1～3在SHSY5Y細胞系中有一定的高表達，對SUMO修飾的增減變化起了放大的作用，并通過Flag對SUMO進行標記，選用抗Flag抗體進行放大，增加了SUMO變化的可檢測性，很好地解決了商品化的SUMO抗體因檢測的特異性和靈敏性偏低對結合態和游離態的SUMO蛋白表達顯示不清晰的問題。

目前大多數轉染實驗使用的是脂質體轉染，轉入細胞的基因表達會隨著細胞的傳代逐漸降低。而經逆轉錄病毒系統包裝后的外源基因可以穩定高效地整合入宿主基因組，穩定介導基因表達;包裝成熟的病毒顆粒以出芽生殖的方式進入到細胞培養液上清液中，易于與宿主細胞分離，制備方便［8，9］。本研究通過酶切與亞克隆技術成功構建了重組逆轉錄病毒質粒pBabe-3×Flag-SUMOs-pruo，通過轉染及篩選產生高滴度逆轉錄病毒顆粒，并感染SHSY5Y細胞，得到了穩定表達的 pBabe-3×Flag-SUMOs-SHSY5Y細胞系，為進一步研究SUMO在神經系統蛋白翻譯后修飾及信號轉導中的作用奠定了基礎。

［1］Geiss-Friedlander R，Melchior F.Concepts in sumoylation:a decade on［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8(12):947-956.

［2］Johnson ES.Protein modification by SUMO［J］.Annu Rev Biochem，2004，73(16):355-382.

［3］Krumova P，Weishaupt JH.Sumoylation in neurodegenerative diseases［J］.Cell Mol Life Sci，2012，69(21):335-340.

［4］Song GG，Choi SJ，Ji JD，et al.Association between the SUMO4 M55V(A163G)polymorphism and susceptibility to type 1 diabetes:a meta-analysis［J］.Hum Immunol，2012，73(10):1055-1059.

［5］Kamoun M，Ben-Dhifallah I，Karray E，et al.Association of small ubiquitin-like modifier 4(SUMO4)polymorphisms in a Tunisian population with Behcet's disease［J］.Clin Exp Rheumatol，2010，28(4 Suppl 60):45-49.

［6］Morales-Hernandez A，Sanchez-Martin FJ，Hortigon-Vinagre MP，et al.2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin induces apoptosis by disruption of intracellular calcium homeostasis in human neuronal cell line SHSY5Y［J］.Apoptosis，2012，17(11):1170-1181.

［7］Hay RT.SUMO:a history of modification［J］.Mol Cell，2005，18(1):1-12.

［8］Gama-Sosa MA，De Gasperi R，Elder GA.Animal transgenesis:an overview［J］.Brain Struct Funct，2010，214(2-3):91-109.

［9］Kitamura T，Koshino Y，Shibata F，et al.Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning:powerful tools in functional genomics［J］.Exp Hematol，2003，31(11):1007-1014.