clock基因在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)變化

陳曉巍，王 凡，陳治軍，劉平非，羅 勇，梁 武，夏鶴春

(1 荊門市第一人民醫(yī)院，湖北荊門 448000;2 寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

生物晝夜節(jié)律是一種基本的生命活動(dòng)現(xiàn)象，廣泛存在于從簡(jiǎn)單的單細(xì)胞生物到高等的哺乳動(dòng)物之中［1，2］。其中最主要也最基本的分子機(jī)制是生物鐘基因(clock)及其蛋白產(chǎn)物構(gòu)成的自主調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄—翻譯反饋回路，而clock基因則是該反饋通路中最為核心的元件［3，4］。近年研究發(fā)現(xiàn)，clock基因的表達(dá)異常可能會(huì)導(dǎo)致乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生［5］。2008年7月 ～2010年11月，我們檢測(cè)了clock基因在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，探討其與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇湖北省荊門市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科2008年7月～2010年11月手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本67份，以膠質(zhì)瘤組織作為膠質(zhì)瘤組，以瘤周的非瘤組織作為對(duì)照組。患者術(shù)前均未行放療或化療。根據(jù)2007年WHO分級(jí)和分類標(biāo)準(zhǔn)，膠質(zhì)瘤組為Ⅰ～Ⅱ級(jí)36份(患者年齡35～58歲)、Ⅲ～Ⅳ級(jí)31份(患者年齡23～68歲)。Maxwell?16 Total RNA Purification Kit購自于美國Promega公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ImProm-IITM Reverse Transcription System購自美國Promega公司，PCR試劑盒購自天根公司，羊抗人clock及羊抗人PCNA一抗購自Santa Cruz公司，兔抗羊IgG抗體-HRP多聚體(PV-6002)和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 clock mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。將腫瘤及周邊非瘤組織手術(shù)切除后立即浸泡于0.4%的DPEC溶液中，于無核酶條件下采用RNA提取試劑盒提取總RNA，取2 μg總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以2 μL cDNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，以hGAPDH為參照基因。clock基因序列為F:AGTTAGGGCTGAAAGACGACG，R:TTGCTTCTATCATGCGTGTCC，片段長(zhǎng)度479 bp;hGAPDH序列為F:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，R:AGGGGGCCATCCACAGTCTTC，片段長(zhǎng)度266 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，置于Bio-Rad凝膠成像儀上成像，用Multi-Analyst軟件進(jìn)行結(jié)果分析，以clock條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值的比值表示clock mRNA的相對(duì)表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 clock及PCNA蛋白檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法。將兩組石蠟標(biāo)本制成10 μm厚切片，所有切片置于高壓鍋中，加熱沸騰5 min進(jìn)行抗原修復(fù)。完全冷卻后，3%H2O2孵育15 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗，3 min×3次，滴加一抗(clock抗體1∶400，PCNA 抗體1∶200)，4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗，3 min×3次，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗，3 min×3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水封片，鏡下觀察。clock染色以細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性，PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)以胞核及胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性。按陽性細(xì)胞所占比例及染色深度計(jì)分。陽性細(xì)胞比例≤24%為1分，25% ～50%為2分，51～75%為3分，≥76%為4分;無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者乘積0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用Pearson χ2檢驗(yàn)、Fisher's確切概率法及 Spearman 秩相關(guān)分析法，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 clock基因mRNA表達(dá) 膠質(zhì)瘤組及對(duì)照組clock基因 mRNA表達(dá)量分別為 5.062±0.104、2.653 ± 0.091，P ＜0.01。膠質(zhì)瘤組Ⅰ ～ Ⅱ級(jí)者clock基因mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);Ⅲ～Ⅳ級(jí)者clock基因mRNA表達(dá)高于Ⅰ ～ Ⅱ級(jí)者(P ＜0.05)及對(duì)照組(P ＜0.05)。

2.2 clock蛋白表達(dá) 膠質(zhì)瘤組及對(duì)照組clock蛋白陽性率分別為 70.20%(47/67)、52.23%(35/67)，P＜0.01。膠質(zhì)瘤組Ⅰ ～Ⅱ級(jí)者、Ⅲ ～Ⅳ級(jí)者clock蛋白陽性率分別為 54.29%(19/35)、87.5%(28/32)，Ⅲ～Ⅳ級(jí)者clock蛋白陽性率高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)者及對(duì)照組(P均＜0.05)。

2.3 PCNA蛋白表達(dá) 對(duì)照組PCNA蛋白無表達(dá)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PCNA陽性率100%，且Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中強(qiáng)陽性率(84.38%)明顯高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤組織(48.57%)(P ＜0.05)。

2.4 clock與PCNA的相關(guān)性 膠質(zhì)瘤組clock陽性表達(dá)與PCNA陽性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.273，P＜0.05)。見表 1。

表1 clock與PCNA表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

clock基因是生物鐘基因中最為重要的調(diào)控因子，在生物節(jié)律系統(tǒng)的自動(dòng)調(diào)整反饋循環(huán)中處于核心地位。clock基因參與了對(duì)節(jié)律控制基因的調(diào)控作用，而后者被認(rèn)為廣泛存在于機(jī)體各個(gè)生命活動(dòng)中，其中包括細(xì)胞生長(zhǎng)周期［6，7］。研究發(fā)現(xiàn)，clock 基因敲除小鼠體內(nèi)的成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)能力明顯弱于野生型小鼠［8］。clock基因缺陷小鼠體內(nèi)的淋巴組織具有明顯的凋亡傾向［9］。乳腺癌患者癌組織中clock基因表達(dá)量明顯高于非乳腺癌患者［10］。上述研究結(jié)果顯示，clock基因可能是腫瘤發(fā)生的促進(jìn)因子。本研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組clock基因mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，且在Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤及對(duì)照組;clock蛋白的表達(dá)也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，膠質(zhì)瘤組clock蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，且在Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤及對(duì)照組，提示膠質(zhì)瘤細(xì)胞可能與患者自身存在不同的晝夜節(jié)律。

PCNA為增殖細(xì)胞核抗原，與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)方面起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PCNA陽性率100%，且Ⅲ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤組織中強(qiáng)陽性率(84.38%)明顯高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤組織(48.57%)，clock蛋白與PCNA陽性表達(dá)呈正相關(guān)，提示clock蛋白的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)存在促進(jìn)關(guān)系。

結(jié)合文獻(xiàn)我們認(rèn)為，clock主要通過兩方面影響了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。一是影響細(xì)胞周期。由于人體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的限速因子細(xì)胞周期蛋白絕大數(shù)受clock基因控制，有學(xué)者推測(cè)，clock蛋白可能是一種轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的重要基因來達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用［11］。最近有研究表明，clock蛋白是一種組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶，可以通過另外的潛在調(diào)節(jié)途徑來影響細(xì)胞周期的進(jìn)程［12］。二是失去了對(duì)clock基因的反作用因子。Per1、Per2是clock轉(zhuǎn)錄—翻譯反饋通路中最為重要的反式作用因子［1～3］。研究發(fā)現(xiàn)，Per1、Per2 基因在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯低于瘤周組織，提示膠質(zhì)瘤的起源與Per1、Per2基因的表達(dá)減弱密切相關(guān)［13］。我們推測(cè)在膠質(zhì)瘤組織中Per1、Per2基因的表達(dá)減弱，使clock基因的轉(zhuǎn)錄負(fù)性因素減弱，破壞了正常轉(zhuǎn)錄—翻譯反饋回路的運(yùn)行，從而影響了細(xì)胞生長(zhǎng)周期的正常運(yùn)行。

盡管有關(guān)clock基因與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制還尚未明確，但卻為膠質(zhì)瘤的臨床治療開辟了一條新的思路，為膠質(zhì)瘤的生物治療及基因靶向治療提供了理論基礎(chǔ)。

［1］Reppert SM，Weaver DR.Coordination of circadian timing in mammals［J］.Nature，2002，418(6901):935-941.

［2］Morse D，Sassone-Corsi P.Time after time:inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators［J］.Trends Neurosci，2002，25(12):632-637.

［3］Reppert SM，Weaver DR.Molecular analysis of mammalian circadian rhythms［J］.Annu Rev Physiol，2001，63(4):647-676.

［4］Panda S，Antoch MP，Miller BH，et al.Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock［J］.Cell，2002，109(3):307-320.

［5］Lee CC.Tumor suppression by the mammalian period genes［J］.Cancer Causes Control，2006，17(4):525-530.

［6］Gekakis N，Staknis D，Nguyen HB，et al.Role of the clock protein in the mammalian circadian mechanism［J］.Science，1998，280(5369):1564-1569.

［7］Matsuo T，Yamaguchi S，Mitsui S，et al.Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo［J］.Science，2003，302(5643):255-259.

［8］Miller BH，McDearmon EL，Panda S，et al.Circadian and clock controlled regulation of the mouse transcriptome and cell proliferation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(9):3342-3347.

［9］Antoch MP，Gorbacheva VY，Vykhovanets O，et al.Disruption of the circadian clock due to the clock mutation has discrete effects on aging and carcinogenesis［J］.Cell Cycle，2008，7(9):1197-1204.

［10］Aaron EH，Yi CH，Zheng TZ，et al.Clock in breast tumorigenesis:genetic，epigenetic，and transcriptional profiling analyses［J］.Cancer Res，2010，70(4):1459-1468.

［11］Young MW，Kay SA.Time zones:a comparative genetics of circadian clocks［J］.Nat Rev Genet，2001，2(9):702-715.

［12］Kalamvoki M，Roizman B.Circadian clock histone acetyl transferase localizes at ND10 nuclear bodies and enables herpes simplex virus gene expression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(41):17721-17726.

［13］Xia HC，Niu ZF，Ma H，et al.Deregulated expression of the Per1 and Per2 in human gliomas［J］.Can J Neurol Sci，2010，37(3):365-370.