PKC對雷帕霉素抑制內皮生長暈細胞作用的影響及機制

邵小琳

(山東醫學高等專科學校，山東臨沂 276000)

雷帕霉素藥物洗脫支架是臨床治療冠狀動脈狹窄應用最為廣泛的支架之一，緩慢洗脫的藥物可以抑制平滑肌細胞增殖和遷移，降低支架植入術后的再狹窄率。內皮生長暈細胞(EOCs)是血管內皮細胞的前體細胞，具有高度增殖潛能及強大的成血管能力，對預防PCI術后再狹窄具有重要意義［1］。研究表明，雷帕霉素在抑制血管平滑肌細胞增生的同時也降低了EOCs的活性［2］，從而抑制了支架術后損傷內皮的修復，導致術后血栓形成和內膜增生，成為雷帕霉素藥物洗脫支架的弊端之一。內皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化產生的NO能夠促進EOCs發揮功能［3，4］，而蛋白激酶 C(PKC)與 eNOS 及 NO 均有密切關系［5，6］。2011 年10月 ～2012年6月，我們應用PKC抑制劑Go6976抑制PKC的活性，觀察PKC對雷帕霉素干預后的EOCs的作用，以進一步明確雷帕霉素抑制EOCs的機制，為改善雷帕霉素藥物洗脫支架植入術后的效果提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 EGM-2培養基購自Lonza公司，胎牛血清購自Gibco公司，人纖維連接蛋白購自Chemicon公司，異硫氰基熒光素標記荊豆凝集素Ⅰ(FITCUEA-Ⅰ)購自 Sigma公司，Dil標記的乙酰化 LDL(DiI-ac-LDL)購自 Invitrogen公司，Ⅷ因子抗體、CD34抗體、Flk-1抗體購自Boster公司，CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所中國(上海)代表處，Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 參照Ingram等［7］報道的方法進行。收集2011年10月～2012年5月棄用的健康產婦的新鮮胎盤臍帶血30例，每次采血量約30 mL。采用密度梯度離心法收集臍血中的單個核細胞，重懸于2 mL含10%胎牛血清的EGM-2培養液中，接種于在人纖維連接蛋白預包被的六孔板的一個孔內。置培養箱中培養24 h，吸棄孔內培養液，用PBS輕柔洗去未貼壁細胞并更換新鮮培養液。此后7 d內每天更換一半培養液，7 d后每3 d更換全部培養液。待原代細胞生長匯合約80%后傳代，進行下一步實驗。

1.2.2 細胞鑒定 ①免疫細胞染色法:取第2代細胞接種至24孔板中，培養至貼壁。采用40 g/L多聚甲醛固定20 min，0.3%H2O2-甲醇液封閉內源性過氧化物酶10 min，PBS浸洗后分別加1∶100稀釋的CD34、Flk-1、Ⅷ因子一抗，4℃孵育過夜。二抗結合參照ABC免疫組化檢測試劑盒說明書進行，之后用AEC染色試劑染色，蘇木素復染，于倒置相差顯微鏡下(×200)觀察染色結果。以CD34、Flk-1、Ⅷ因子染色均為陽性為正在分化的EOCs細胞。②熒光染色法:在上述細胞中加入DiI-ac-LDL(10 mg/L)37℃孵育4 h，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS浸洗后將FITC-UEA-Ⅰ(10 mg/L)加于上述標本中，37℃孵育1 h。采用熒光顯微鏡觀察染色結果。DiI-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙染色陽性細胞為正在分化的EOCs細胞。采用密度梯度離心法分離獲得的單個核細胞在培養第4～6 d開始出現梭形細胞，第7～9 d形成若干個細胞集落，繼續培養細胞呈橢圓形鋪路石樣排列，見圖1。免疫細胞染色顯示:培養16～21 d的 EOCs表面 CD34、Flk-1、Ⅷ因子相關抗原表達均為陽性，見圖2。DiI-ac-LDL和 FITCUEA-Ⅰ熒光染色后，熒光顯微鏡觀察到雙染色陽性細胞，見封三彩圖3。

圖1 分離培養的EOCs(×100)

圖2 EOCs免疫細胞染色(×200)

1.2.3 細胞干預 取第2代細胞分成4組:①對照組:僅加入配制雷帕霉素的0.3%DMSO溶劑;②Go6976 組:加入 1 μmol/L Go6976;③Go6976+雷帕霉素組:加入 1 μmol/L Go6976，30 min后再加入10 μmol/L雷帕霉素;④雷帕霉素組:加入10 μmol/L雷帕霉素。各組細胞繼續培養24 h后觀察結果。

1.2.4 細胞增殖能力檢測 第2代細胞生長至融合，0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞，重懸后計數，以1×104個/孔接種到96孔培養板，24 h后更換無血清的培養基同步24 h，然后隨機分組處理，每組3個復孔，24 h后更換新鮮培養液，每孔加入10 mL CCK-8細胞計數試劑，于37℃孵育2.5 h，酶標儀450 nm下讀取吸光度OD值。

1.2.5 細胞遷移能力檢測 第2代細胞生長至融合，0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞，重懸后計數。以相同細胞數接種到24孔培養板，24 h后更換無血清的培養基同步24 h，然后隨機分組處理，每組3個復孔，24 h后消化收集各組貼壁細胞，加入含0.1%BSA的無血清培養基制備成細胞懸液，調整細胞密度，于24孔板中放入Transwell小室(孔徑8 μm)。下室加入600 μL含10%FBS的培養基，上室加入100 μL細胞懸液，在培養箱中孵育24 h。取出Transwell小室，PBS沖洗，用棉簽擦去微孔膜上層的細胞，4%多聚甲醛固定10 min，0.25%結晶紫染色。隨機計數5個視野(×400)內的 EOCs數，評價EPCs的遷移能力。

1.2.6 黏附能力檢測 第2代細胞生長至融合，0.05%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞，重懸后計數，以相同細胞數接種到24孔培養板，24 h后更換無血清的培養基同步24 h，然后隨機分組處理，每組3個復孔，24 h后收集各組貼壁細胞，制備成細胞懸液，調整細胞密度，將相同細胞數的EOCs接種到96孔板，每組設6個復孔，置培養箱中培養30 min后，用Hanks液輕柔洗去各孔未貼壁細胞，倒置相差顯微鏡下隨機取10個視野(×400)計數貼壁EOCs數。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0軟件包，計量資料以表示，組間資料比較采用ANOVA單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗，方差不齊者采用Dunnett'sT3檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖能力 雷帕霉素組EOCs增殖能力低于對照組(P＜0.01)。Go6976+雷帕霉素組高于雷帕霉素組(P＜0.01)。Go6976組高于雷帕霉素干預組(P ＜0.01)。見表1。

2.2 細胞遷移能力 雷帕霉素組EOCs遷移能力低于對照組(P＜0.01)。Go6976+雷帕霉素組高于雷帕霉素組(P＜0.01)。Go6976組EOCs高于雷帕霉素組(P＜0.01)，但與對照組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1、圖4。

2.3 細胞黏附能力 雷帕霉素組EOCs黏附能力低于對照組(P＜0.01);Go6976+雷帕霉素組高于雷帕霉素組(P＜0.01)。Go6976組高于雷帕霉素干預組(P＜0.01)，但與對照組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 各組EOCs增殖、遷移、黏附能力檢測結果()

表1 各組EOCs增殖、遷移、黏附能力檢測結果()

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與雷帕霉素組比較，△P ＜0.01

組別 增殖能力(OD值)遷移能力(個/視野)黏附能力(個/視野)Go6976 組 1.16 ±0.04△ 55.87 ±2.01△ 7.93 ±1.07△Go6976+雷帕霉素組 1.07±0.08△ 52.80±3.08△ 6.55±0.68△雷帕霉素組 0.77 ±0.09* 30.93 ±1.62* 2.42 ±0.74*對照組 1.07 ±0.03△ 54.07 ±2.76△ 7.08 ±1.13△

圖4 EOCs遷移能力(×400)

3 討論

內皮祖細胞(EPCs)是骨髓干細胞的亞群，是血管內皮細胞的前體細胞，不僅在血管新生中作用顯著，而且具有強烈的內皮保護作用。EPCs主要分為兩種不同類型，即早期內皮祖細胞和晚期內皮祖細胞(也稱內皮生長暈細胞，即EOCs)［8］。研究表明，EPCs參與冠心病介入治療后損傷內皮的修復，能夠促進再內皮化過程［9～12］，維持血管內皮完整性，抑制血栓形成和內膜增生，對降低PCI術后血管再狹窄發生率具有重要作用。與早期EPCs相比，EOCs具有更高的增殖潛能和成血管能力［1］。EOCs參與損傷血管內皮的修復，并可以促進支架術后內皮化，在損傷血管再內皮化的過程中的地位更為重要［13］。

雷帕霉素藥物洗脫支架是臨床應用最為廣泛的藥物洗脫支架之一。緩慢洗脫的雷帕霉素可以抑制血管中膜平滑肌細胞的增生，使其細胞周期停滯在G1/S期，從而減少了內膜的增厚。同時大量研究表明，雷帕霉素在抑制血管平滑肌細胞增生的同時也抑制了 EPCs活性［14～16］，使損傷血管的再內皮化過程受到抑制，血管完整性遭到破壞，局部的炎癥反應使得血栓形成增加，并且促進血管中層平滑肌細胞的反應性增生，使得內膜增厚，血管再狹窄率增加［13］。由此可見，雷帕霉素藥物洗脫支架在冠心病介入治療中的作用是一把雙刃劍。研究雷帕霉素對EPCs功能的作用機制，找出阻斷或減弱其抑制EPCs的方法或途徑，將對雷帕霉素藥物洗脫支架的應用帶來更廣闊的前景。

PKC是由一系列絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成的家族，PKC的活化可以抑制eNOS活性從而降低NO 的產生［3，4］，而 eNOS、NO 在 EPCs的動員、歸巢、分化、增殖、遷移、黏附等方面發揮著重要作用［5，6］，是EPCs重要的生物活性分子。本研究發現，應用PKC抑制劑Go6976干預EOCs后，可顯著改善雷帕霉素對EOCs功能的抑制，EOCs功能基本恢復到與對照組同一水平，考慮PKC可能被激活參與了雷帕霉素對EOCs功能的抑制過程，提示抑制PKC活性可改善雷帕霉素對EOCs功能的抑制作用。

本研究結果為雷帕霉素抑制EPCs的機制提出了新的認識，為如何提高雷帕霉素支架術后EOCs的活性提供了新的方法和思路。關于PKC參與雷帕霉素導致EOCs功能抑制的作用機制尚待進一步研究。

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