尿酸對腎小管上皮細胞sICAM-1表達的影響及其機制探討

郭吉雷，李 晶，陳 明

(1 新泰市人民醫院，山東新泰 271200;2 成都中醫藥大學附屬醫院)

近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，特別是富含蛋白質和嘌呤食物攝入的增加，高尿酸血癥(HUA)和痛風的發病人數逐年上升［1］。HUA是腎臟疾病進展的獨立危險因素，高濃度的尿酸對腎臟有直接的致病作用［2，3］，其危險性甚至高于蛋白尿［4］。但高尿酸損傷腎臟的機制尚待證實。研究發現，在多種腎小球和腎小管疾病中，腎小管上皮細胞都明顯表達可溶性細胞間黏附分子-1(sICAM-1)［5，6］。2009 年 10 月 ～2010 年 5 月，我們觀察了不同濃度尿酸對體外培養的腎小管上皮細胞sICAM-1及NF-κB表達的影響，探討尿酸損害腎小管上皮細胞的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細胞株由重慶醫科大學腎內科實驗室惠贈，RPMI1640培養粉劑、胎牛血清、胰蛋白酶、尿酸購自Solarbio公司，ELISA試劑盒購自美國Abzoom公司，兔抗人NF-κB多抗購自武漢博士德生物工程有限公司，SABC試劑盒與DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及干預 取液氮凍存的HK-2細胞株，常規解凍后用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，置于37℃、5%CO2孵箱中培養，每3～4 d換液1次，至細胞生長達90%融合后進行傳代培養。取對數生長期細胞，用0.25%胰酶消化后制備細胞懸液，并以5×105/孔接種于6孔培養板中，12 h后用無血清RPMI1640培養液同步化處理24 h。將對數生長期HK-2細胞分為對照組及尿酸2 mg/dL組、尿酸7 mg/dL組、尿酸12 mg/dL組、尿酸17 mg/dL組、尿酸22 mg/dL組，每組設3個復孔。對照組僅加入10%胎牛血清普通RPMI1640培養液，其余各組加入相應劑量的尿酸。

1.2.2 細胞NF-κB蛋白表達檢測 分別于干預后12、24、48 h采用免疫組化法檢測各組HK-2細胞液中NF-κB的表達。用PBS洗滌細胞爬片5 min×3次后，用95%乙醇固定，用0.3%H2O2甲醇溶液室溫孵育 10 min，加 0.3%TritonX-100室溫 10 min，5%BSA封閉非特異抗原，用濾紙將多余血清吸去，分別滴加一抗(羊抗人NF-κB多抗)50 μL于待測區域細胞上，4℃孵育過夜;滴加二抗(生物素標記)工作液30 μL;滴加SABC復合物，DAB顯色，蘇木素輕度復染，梯度酒精脫水。倒置顯微鏡下觀察細胞爬片NF-κB染色情況，并攝取圖像，采用Image-Pro Plus(IPP)6.0專業圖像分析軟件半定量分析NF-κB蛋白表達量。

1.2.3 細胞 sICAM-1蛋白表達檢測 采用ELISA法。收集上清液，將細胞上清液置入EP管，低溫離心，取上清液置入EP管，放入-20℃冷凍室。取出酶標板，依照次序對應分別加入標準品50 μL于空白微孔中，分別標記樣品編號，加入樣品50 μL于空白微孔中。在樣品孔中加入生物素標記液10 μL，標準品孔和樣品孔中加入酶標記溶液100 μL。(36±2)℃孵育反應60 min。洗板機清洗5次，每孔加入底物A、B液各50 μL。(36±2)℃下避光孵育反應15 min。每孔加入終止液50 μL，終止反應。于波長450 nm的酶標儀上讀取各孔濃度值。

1.3 統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件，數據用表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法;相關分析采用Spearman等級相關分析法。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組sICAM-1表達 見表1。

表1 各組尿酸干預不同時點sICAM-1蛋白表達變化(IOD 值，)

表1 各組尿酸干預不同時點sICAM-1蛋白表達變化(IOD 值，)

注:與同時間點對照組比較，*P＜0.05

組別 sICAM-1蛋白表達12 h 24 h 48 h尿酸2 mg/dL組43.43 ±1.09 43.29 ±0.98 44.20 ±1.71尿酸7 mg/dL 組 44.33 ±1.61 45.14 ±1.17 45.60 ±0.82尿酸12 mg/dL 組 44.51 ±0.87 44.29 ±1.35 45.40 ±1.88尿酸17 mg/dL 組 56.46 ±1.31* 59.78 ±2.07* 65.14 ±1.89*尿酸22 mg/dL 組 70.37 ±1.95* 77.62 ±2.48* 82.35 ±1.29*對照組42.77 ±0.67 43.06 ±0.75 43.72 ±1.54

2.2 各組NF-κB表達 免疫組化結果顯示，NF-κB蛋白陽性染色信號為棕黃色顆粒，定位于細胞質或細胞核。對照組NF-κB蛋白主要表達于細胞質內，細胞核表達較少，見圖1～3。與對照組比較，尿酸17 mg/dL組、尿酸22 mg/dL組NF-κB表達明顯增多(P＜0.05)，且隨時間表達明顯增多，呈時間依賴性。見表2。相關性分析表明，NF-κB與 sICAM-1表達呈正相關(r=0.998，P ＜0.05)。

表2 各組尿酸干預不同時點NF-κB蛋白表達(IOD 值，)

表2 各組尿酸干預不同時點NF-κB蛋白表達(IOD 值，)

注:與同時間點對照組比較，*P＜0.05

組別 NF-κB蛋白表達12 h 24 h 48 h尿酸2 mg/dL組137.23 ±6.01 142.45 ± 5.28139.35 ± 6.01尿酸7 mg/dL 組 141.14 ±5.57 141.78 ± 6.27144.01 ± 5.82尿酸12 mg/dL 組 138.44 ±7.21 143.29 ± 5.17141.24 ± 6.31尿酸17 mg/dL 組 202.13 ±9.31*231.24 ± 5.29*258.57 ±10.31*尿酸22 mg/dL 組 270.15 ±9.25*299.56 ±10.13*346.34 ±12.24*對照組138.96 ±5.35 139.16 ± 6.45141.57 ± 5.61

3 討論

圖1 尿酸干預12 h后HK-2細胞NF-κB蛋白表達(×400)

圖2 尿酸干預24 h后HK-2細胞NF-κB蛋白表達(×400)

圖3 尿酸干預48 h后HK-2細胞NF-κB蛋白表達(×400)

尿酸是嘌呤代謝的終產物。人體產生的尿酸約30%被腸道細菌分解清除，其余70%通過腎臟排泄。近年研究證實，血尿酸水平與腎臟疾病有密切關系［4，6～8］。HUA可引起蛋白尿、腎小球組織增生肥大、腎小球硬化和腎間質纖維化，最終引起慢性腎功能衰竭，其機制可能包括:激活腎素—血管緊張素—醛固酮(RAS)系統，使血管緊張素Ⅱ合成增加［9～11］;增加氧化應激［11，12］;激活血管平滑肌絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路以及一系列炎性反應相關因子如胞外信號調節激酶、NF-κB、環氧合酶-2、血栓素花生四烯酸、血小板衍生長因子和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等［13］。

ICAM-1屬于免疫球蛋白超基因家族成員，在內皮細胞、上皮細胞、單核細胞和淋巴細胞上均有表達，是介導細胞黏附所必需的分子，主要參與細胞黏附、炎癥、T細胞的分化發育調節、抗原呈遞與T細胞活化、細胞介導的細胞毒作用，在機體的炎癥、免疫反應中起重要作用。研究證實，在多種腎小球和腎小管疾病中，尤其是急進性腎炎、新月體腎炎、狼瘡性腎炎、急性腎小管壞死和移植腎排斥反應等炎癥性疾病中，腎小管上皮細胞都明顯表達ICAM-1［14，15］。sICAM-1 是 ICAM-1 脫落后于血液中的可溶形式，sICAM-1的量與細胞表面ICAM-1的分子數量呈正比。sICAM-1水平可間接反映內皮細胞和抗原遞呈細胞表面ICAM-1的表達量。本研究發現，與對照組相比，尿酸干預后尿酸2 mg/dL組、尿酸7 mg/dL組及尿酸12 mg/dL組sICAM-1表達無顯著變化，而尿酸17 mg/dL組、尿酸22 mg/dL組不僅表達明顯增多，且隨時間表達明顯增多，呈時間依賴性，提示高濃度尿酸可使細胞液中sICAM-1的量明顯增多，反映細胞表面ICAM-1的表達量增多。增多的ICAM-1可能引起一些炎癥介質表達，進而引起腎臟病變，提示尿酸可以引起腎小管上皮細胞ICAM-1的表達增多。

NF-κB是一種廣泛存在于細胞中、具有多向性轉錄調節作用的蛋白質，在機體的免疫反應、炎癥反應的調控等方面發揮重要作用。活化的NF-κB能調節多種分子的表達，如 TNF-α、IL-6、IL-8、誘導型氮氧化物合酶(iNOS)等。NF-κB在腎臟的腎小球細胞和腎小管上皮細胞中廣泛存在。本研究發現，與對照組相比，尿酸干預后尿酸17 mg/dL組、尿酸22 mg/dL組NF-κB表達明顯增多，且隨時間表達增多，呈時間依賴性，提示高尿酸可刺激HK-2細胞NF-κB活化表達增多，進而引起炎癥介質的表達。

研究發現，NF-κB是ICAM-1的激活途徑之一。NF-κB是一個普遍存在的轉錄因子，可調節ICAM-1、TNF-α、IL-l、IL-6 等與炎癥相關的因子表達［16］。Zou 等［17］證實 NF-κB的活化可以誘導ICAM-1的表達上調，造成血管內皮和腸上皮細胞的損傷。Glushakova等［18］發現果糖可以引起人血管內皮細胞產生尿酸增多，通過激活NF-κB途徑引起ICAM-1的表達增多。本研究發現，與對照組相比，尿酸干預后NF-κB和sICAM-1表達均明顯增多，且兩者呈正相關，提示尿酸可能通過激活NF-κB途徑引起腎小管上皮細胞sICAM-1的表達。

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