白介素18基因啟動子區－137G/C單核苷酸多態性與顱內動脈瘤發病和破裂的關系研究

陳 廣，李云超，邱 虹，于向東，邵德明

顱內動脈瘤 (IAs)是一種致死率高、致殘率高的腦血管疾病，病因和發病機制至今尚未完全明了。本研究旨在通過病例－對照研究的方法，運用聚合酶鏈式反應－限制性片段長度多態性 (PCR－RFLP)及DNA直接測序檢測我院和唐山市工人醫院收治的195例IAs患者的白介素 (IL) －18基因啟動子區－137G/C單核苷酸多態性 (SNP)位點的基因型頻率和等位基因頻率，探索IL－18基因多態性與IAs發病、破裂的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年3月—2009年10月在河北聯合大學附屬開灤總醫院和唐山市工人醫院神經外科住院治療的IAs患者98例 (動脈瘤組)，均為唐山地區漢族人;其中男47例，女51例;年齡30～70歲;均通過全腦血管造影 (雙側椎動脈、雙側頸內動脈、雙側頸外動脈)確診為顱內囊性動脈瘤;均無IAs及蛛網膜下腔出血 (SAH)家族史，并且排除常染色體顯性遺傳性多囊腎病 (ADPKD)、Ehlers－Danlos綜合征Ⅳ型和馬凡綜合征。將動脈瘤組進一步分為破裂組62例和未破裂組36例;破裂引起的SAH經顱腦CT或腰椎穿刺證實，破裂組均為初發SAH。因自發性SAH入院，但經數字減影血管造影 (DSA)檢查未發現IAs的患者，或確診為腦血管畸形、動靜脈瘺、煙霧病患者，未列入本研究。另選取同期住院治療的非腦血管疾病患者97例 (對照組)，其中男53例，女44例;年齡33～72歲;均經顱腦MRA、螺旋CT血管成像(CTA)或DSA檢查排除IAs。動脈瘤組和對照組均無卒中病史、無IAs及SAH家族史、無遺傳性結締組織病史，病例彼此間無親緣關系。動脈瘤組與對照組患者的性別、年齡、既往史 (高血壓史、糖尿病史、冠心病史)、個人史 (吸煙史、飲酒史)比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05，見表1)，兩組患者基線標準齊平，具有可比性。

表1 兩組臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical information between two groups

1.2 方法 提取195例患者的外周血基因組 DNA，采用 PCR－RFLP及DNA直接測序的方法檢測IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點的基因型頻率和等位基因頻率。

1.3 統計學方法 資料錄入采用Excel軟件建立數據庫，并進行雙遍錄入及核查，應用SPSS 16.0統計軟件進行分析。計量資料以 (±s)表示，組間比較采用成組t檢驗;計數資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL－18基因啟動子區－137G/C SNP與IAs的關系 標本均成功擴增出目的片段。在瓊脂糖凝膠電泳實驗中均能觀察到對應于相應標記物標記位置的片段。PCR擴增產物為259 bp片段 (見圖1)。

圖1 IL－18基因啟動子區－137G/C電泳的PCR產物Figure 1 PCR products of electrophoresis of the IL－18 gene－137G/C

2.2 動脈瘤組和對照組IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點的測序結果 經DNA直接測序發現3種基因型:野生型純合子GG，雜合子GC，突變型純合子CC。測序結果見圖2。

圖2 IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點的測序結果Figure 2 Sequencing result of genotypes in IL－18－137G/C SNP

2.3 動脈癌組和對照組IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點多態性分布 動脈瘤組IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點基因型及等位基因分布與對照組比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05)，其中基因型以GG型最多，其次為GC和CC型，等位基因以G多見;動脈瘤組G等位基因的頻率與對照組比較，差異有統計學意義 (P＜0.05，見表2)。

表2 動脈瘤組與對照組IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點的多態性分布〔n(%)〕Table 2 Polymorphism distribution of IL－18－137G/C SNP in IAs patients and controls

2.4 IAs患者破裂組與未破裂組 IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點多態性分布 破裂組IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點基因型及等位基因分布與未破裂組比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05)，其中基因型以GG型多見，其次為CC和GC型，等位基因以G型多見;破裂組G等位基因的頻率與未破裂組比較，差異有統計學意義 (P＜0.05，見表3)。

表3 IAs患者破裂組與未破裂組IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點的多態性分布〔n(%)〕Table 3 Polymorphism distribution of IL－18－137G/C SNP in ruptured and non－ruptured IAs patients

3 討論

IAs的相關致病基因逐漸被人們所重視，并進行了深入研究，不少學者認為IAs是一種由多種環境因素和多個基因共同作用的多基因疾?。?－2］。分子生物學研究表明，IL－18基因存在基因變異及多態性，其多態性可影響IL－18轉錄和翻譯，進而影響IL－18相關的炎性疾病的發生、發展和轉歸［3］。目前對IL－18基因多態性的研究主要是針對過敏性疾病、病毒感染、自身免疫性疾病、腫瘤及損傷后膿毒癥等疾病，研究表明IL－18與這些疾病的發生有一定關系。少數研究對IL－18基因多態性與心血管疾病的關系進行了研究。周超等［4］報道IL－18基因啟動子區－137位點多態性與兒童結核病易患性有關，－137位點等位基因G可影響IL－18蛋白表達，可能是結核病的易患基因。Imboden等［5］報道IL－18基因啟動子區－137位點等位基因G是過敏性哮喘的遺傳危險因素。

越來越多的證據表明，IL－18基因多態性誘導炎癥反應在IAs的發生、發展和破裂的過程中扮演著重要角色。IL－18基因多態性通過誘導炎性反應可以引起白細胞黏附于血管壁，淋巴細胞免疫應答，炎性細胞因子〔IL、腫瘤壞死因子(TNF)等〕、基質金屬蛋白酶 (MMP)和其他蛋白溶解酶釋放，引起血管壁的血管內皮損傷、膠原蛋白減少、細胞外基質降解和重構，并導致血管壁的脆性增加，繼而與其他因素一起導致動脈瘤的發生。Chyatte等［6］為了明確炎癥或免疫反應與IAs的關系，在顯微外科手術中收集了25例患者的動脈瘤組織 (前交通動脈瘤10例、大腦中動脈瘤9例、頸內動脈瘤5例、基底動脈瘤1例)，其中23例未破裂，2例已破裂，動脈瘤直徑 (9.2±4.9)mm;另外從死亡24 h內的尸檢中收集11例基底動脈組織作為對照，兩組間無年齡、性別差異。采用免疫組織化學法對動脈瘤組織研究 (因為部分標本體積太小而無法染色，各組的標本數不同)發現，巨噬細胞和單核細胞(CD68)在近一半 (10/22)的動脈瘤全層陽性，其中6例為彌漫性、4例為局限性浸潤，T淋巴細胞 (CD3)近一半 (6/13)為陽性，而以上細胞在對照組全部 (11例)為陰性;B淋巴細胞 (CD20)在一小部分 (3/19)中為陽性，而對照組也均為陰性;所有動脈瘤標本 (19/19)瘤壁全層補體C3c均為陽性，其中9/19的標本呈彌漫性陽性，而在對照組僅3/11在管腔一側為小片狀陽性;補體C9在絕大部分動脈瘤中(18/19)全層陽性，其中15/19為彌漫性陽性，而對照組3/9為彌漫性陽性，3/9為小片狀陽性且位于管腔側;半數以上的(12/17)免疫球蛋白IgG陽性，其中5/17為彌漫性陽性，而對照組中僅1/9為彌漫性陽性;IgM也有類似的表現;血管細胞黏附分子－1在大多數動脈瘤全層中 (11/14)為陽性，且除1例為局部陽性外，其他均為彌漫性陽性，而在對照組5/7僅在內膜和外膜為陽性，卻無一例全層陽性。以上各種成分可同時存在，但并非絕對。以上發現提示動脈瘤壁存在炎癥反應或免疫反應。另外，Kataoka等［7］研究發現在破裂和未破裂的IAs局部均有大量的巨噬細胞和白細胞侵潤，不僅在破裂的動脈瘤局部存在一定的炎癥反應和免疫反應，而且在未破裂的動脈瘤局部及周圍同樣存在一定的炎癥反應和免疫反應，提示炎癥反應并非動脈瘤破裂所繼發，而是貫穿于IAs的發生、發展和破裂的全過程。

目前國內外對炎性基因SNP與動脈瘤關系的研究已成為熱點，目前已有報道的基因包括:IL－1β基因、IL－6基因、TNF－α基因等。Morgan等［8］研究發現，IL－6基因啟動子區－174G＞C和－572G＞C多態性與動脈瘤發生相關，并對91例高加索動脈瘤患者進行了基因型的測定，與正常人對照后發現，兩組之間在等位基因頻率和基因型上存在顯著差別。動脈瘤組中－572位點上出現C等位基因的頻率以及出現C純合子基因型的頻率顯著高于對照組;而在－174位點上，對照組出現C純合子基因型的頻率顯著高于動脈瘤組。Yamada等［9］在日本人群中證實，TNF基因啟動子－863位點等位基因A和基因型AA與動脈瘤相關。動脈瘤患者中G等位基因和GG基因型頻率均顯著高于正常對照人群。我們認為，雖然不同種族的動脈瘤患者優勢等位基因不同，但這些優勢等位基因必然通過相同的信號轉導途徑導致動脈瘤的發生。

本研究結果顯示，對照組IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點G、C等位基因頻率分別為80.4%、19.6%，與國內其他報道中 IL－18基因啟動子區 －137G/C SNP位點 G(82%)、C(18%)等位基因頻率相一致。IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點各基因型和等位基因頻率在動脈瘤組與對照組之間、破裂組與未破裂組之間均有差異，說明IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點可能在IAs的發病和破裂過程中起主要作用。與對照組比較，IAs患者IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點G等位基因頻率和GG基因型頻率高，而破裂組與未破裂組比較，IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點G等位基因頻率和GG基因型頻率更高。說明IL－18基因啟動子區－137G/C SNP位點G等位基因可能通過如下機制促進IL－18的轉錄和翻譯: －137G/C SNP位點位于IL－18基因轉錄起始點上游的啟動子區，由G變為C改變核因子H4TF－1的結合位點，并由此阻斷受H4TF－1調控的基因轉錄，使IL－18表達水平增加，并誘導γ干擾素 (IFN－γ)的生成和激活，IL－18通過核因子κB途徑促進炎性遞質及黏附分子基因的轉錄合成，它還可以誘導趨化因子和其他多種細胞因子的表達，從而發揮致炎效應。

綜上所述，由于破裂動脈瘤的預后不良，故對于未破裂的動脈瘤而言，發現動脈瘤壁廣泛存在的炎癥反應和免疫反應有著重要的臨床價值。所以基因多態性與動脈瘤壁炎癥反應和免疫反應研究尤為重要。隨著對炎癥和動脈瘤關系的進一步了解，基因多態性的特異性抗炎治療將有助于防止IAs的發生和破裂。

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2 邱虹，李云超，陳廣，等.白介素18基因啟動子區－607C/A多態性與顱內動脈瘤的發病和破裂的關系［J］.中國全科醫學，2012，15(9):3135.

3 Pawlik A，Kurzawski M，Drozdzik M，et al.Interleukin－18 gene(IL18)promoter polymorphisms in patients with rheumatoid arthritis［J］.Scand J Rheumatol，2009，38(3):159 －165.

4 周超，蔣利萍，王春燕，等.重慶漢族兒童IL－18基因啟動子－137G/C多態性及蛋白表達與結核病易感性的關系［J］.重慶醫科大學學報，2008，33(9):1029－1033.

5 Imboden M，Nicod L，Nieters A，et al.The common G －allele of interleukin－18 single－nucleotide polymorphism is a genetic risk factor for atopic asthma.The SAPALDIA Cohort Study ［J］.Clin Exp Allergy，2006，36(2):211－218.

6 Chyatte D，Bruno G，Desai S，et al.Inflammation and intracranial aneurysms［J］.Neurosurgery，1999，45(5):1137－1147.

7 Kataoka K，Taneda M，Asai T，et al.Structural fragility and inflammatory response of ruptured cerebral aneurysms.A comparative study between ruptured and unruptured cerebral aneurysms［J］.Stroke，1999，30(7):1396－1401.

8 Morgan L，Cooper J，Montgomery H，et al.The interleukin －6 gene－174G＞C and－572G＞C promoter polymorphisms are related to cerebral aneurysms［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2006，77(8):915－917.

9 Yamada Y，Metoki N，Yoshida H，et al.Genetic risk for ischemic and hemorrhagic stroke ［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(8):1920－1925.