纈沙坦對尿酸性腎病大鼠腎間質纖維化的干預機制研究

孔翠文，閆 慧，李 靖，楊 堃，王 艷

尿酸性腎病是因血尿酸升高，尿酸鹽晶體在腎臟沉積引起的病變，可導致腎小管間質纖維化。研究表明，慢性缺氧是導致腎間質纖維化的重要因素［1］，目前尿酸性腎病大鼠是否存在缺氧狀態(tài)及纈沙坦對其缺氧狀態(tài)的影響少有報道。缺氧誘導因子－1α (hypoxia－inducible factor－1α，HIF－1α) 是組織缺氧時重要核轉錄因子，是缺氧的可靠標記物［2］。腎臟缺氧的基礎是腎小管周圍毛細血管 (peritubular capillaries，PTC)進行性減少［3］，而血小板反應蛋白 －1(thrombospondin－1，TSP－1)是強烈的抑制血管生成因子［4］。本研究通過酵母和腺嘌呤建立尿酸性腎病大鼠模型，觀察腎臟TSP－1、HIF－1α的動態(tài)表達，探討其是否存在缺氧機制及纈沙坦可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

1.1.1 實驗動物 雄性健康Wistar大鼠 (購于山東魯抗實驗動物中心)36只，體質量 (190±10)g，飼養(yǎng)于青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院SPF級動物實驗房。

1.1.2 試劑 纈沙坦 (北京諾華制藥有限公司)，Trizol試劑、逆轉錄聚合酶鏈反應 (RT－PCR)試劑盒、Premix Ex Taq(大連寶生物工程有限公司)，兔抗大鼠HIF－1α、TSP－1多克隆抗體及DAB顯色試劑、Masson三色染色試劑盒 (福州邁新)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型 36只大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組和纈沙坦組，每組12只。用10%酵母飼料喂養(yǎng)和腺嘌呤100 mg·kg－1·d－1灌胃造模。纈沙坦組在造模同時加用纈沙坦30 mg·kg－1·d－1灌胃治療。正常組用普通飼料喂養(yǎng)，用與纈沙坦組等容積的蒸餾水灌胃。

1.2.2 標本收集與檢測 3組大鼠均在入組后第3周、5周時于代謝籠中留取24 h尿液，每組處死6只大鼠，內眥靜脈采血，摘取腎臟，稱重后縱切，一份固定于4%多聚甲醛溶液，常規(guī)石蠟包埋;另一份放入液氮中用于RT－PCR。全自動生化分析儀檢測血尿酸 (UA)、血肌酐 (Scr)。

1.2.3 腎組織病理 石蠟切片行常規(guī)蘇木素－伊紅染色法(HE)和Masson染色，于高倍鏡下，每張切片隨機采集10個腎皮質區(qū)域互不重疊的視野 (均不含腎小球和較大小動脈)，應用JD801形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)Version 1.0分析，腎間質纖維化相對面積=腎間質陽性染色面積/腎小管間質總面積 (腎小管管腔除外) ×100%，并取平均值。

1.2.4 腎組織TSP－1 mRNA和HIF－1α mRNA水平檢測 根據(jù)Trizol說明書提取腎臟總RNA，并依據(jù)逆轉錄試劑盒說明合成cDNA。取 1 μl cDNA為模板進行 PCR擴增 (終體系20 μl)。引物序列及產(chǎn)物長度見表1。反應條件:預變性，95℃ 5 min，1個循環(huán);PCR反應，98℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán)，72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物定量:產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化已錠染色，凝膠成像系統(tǒng)掃描DNA條帶，并應用Quantity One 4.6軟件分析灰度值。各組基因相對表達量以目的基因/β－actin的灰度比值來表示。

表1 RT－PCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT－PCR

1.2.5 腎臟免疫組織化學法檢查 常規(guī)脫蠟，SP法檢測腎組織TSP－1、HIF－1α表達，具體步驟按試劑盒說明書進行，以腎實質及間質細胞出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性著色，采集及分析切片圖像信息，方法同Masson染色，腎小管間質相對陽性面積=腎小管間質陽性染色面積/腎小管間質總面積 (去除腎小管管腔) ×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料數(shù)據(jù)以 (±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK法檢驗;兩指標間的相關性采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠的體質量及血生化指標水平 3組大鼠3周和5周時測得的體質量、UA、Scr水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。模型組和纈沙坦組與對照組比較，大鼠3周、5周時的體質量、UA、Scr水平間差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);纈沙坦組與模型組比較，大鼠3周和5周時的體質量、Scr水平間差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01，見表2)。

2.2 腎臟病理學

2.2.1 病理改變 正常組大鼠腎臟基本正常，HE染色、Masson染色顯示膠原主要位于腎小管基底膜、Bowman囊等處(見圖1A、圖2A)。(2)模型組大鼠3周時腎小球輕度腫大，腎小管上皮細胞輕度萎縮并有空泡變性，間質可見大量單核細胞、淋巴細胞浸潤，可見藍染的膠原纖維;5周時可見尿酸鹽晶體，腎小管上皮萎縮，藍染膠原纖維明顯增多 (見圖1B、圖2B)。(3)與模型組相比，纈沙坦組腎臟尿酸鹽晶體明顯減少，纖維化程度減輕 (見圖1C、圖2C、表3)。

2.2.2 免疫組織化學 3組大鼠3周和5周時測得的腎臟HIF－1α、TSP－1表達量間差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。模型組、纈沙坦組的表達量均高于正常組，模型組的表達量亦高于纈沙坦組，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見表3)。正常組腎臟HIF－1α僅在皮髓質交界處腎小管上皮細胞散在表達;模型組和纈沙坦組HIF－1α的表達量增加，主要位于腎小管上皮細胞和間質成纖維細胞、炎細胞的胞核和胞質 (見圖3)。正常組腎臟TSP－1僅少量表達于腎小球壁層和腎間質。模型組和纈沙坦組TSP－1的表達量增加，廣泛表達于腎小管上皮細胞的胞質 (見圖4)。

2.3 RT－PCR結果 3組大鼠3周和5周時RT－PCR測得的TSP－1 mRNA、HIF－1α mRNA表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。模型組和纈沙坦組3周和5周時TSP－1 mRNA、HIF－1α mRNA的表達量均高于正常組，模型組3周和5周時TSP－1 mRNA、HIF－1α mRNA的表達量亦均高于纈沙坦組，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05，見圖5、圖6)。

圖1 5周后3組大鼠HE染色結果 (×200)Figure 1 HE staining of three groups at 5 week

圖2 5周后3組大鼠Masson染色結果 (×400)Figure 2 Masson staining of three groups at 5 week

圖3 5周后3組大鼠HIF－1α免疫組織化學結果 (×400)Figure 3 HIF－1α expression by immunohistochemistry of three groups at 5 week

圖4 5周后3組大鼠TSP－1免疫組織化學結果 (×400)Figure 4 TSP－1 expression by immunohistochemistry of three groups at 5 week

2.4 相關性分析 模型組大鼠3周和5周時腎組織TSP－1 mRNA與HIF－1α mRNA的表達分別呈正相關 (r值分別為0.821和0.736，P＜0.05)。

表2 3組大鼠的體質量及血生化指標水平比較 (±s)Table 2 Comparison of body mass and biochemical indexes of rats in three groups

表2 3組大鼠的體質量及血生化指標水平比較 (±s)Table 2 Comparison of body mass and biochemical indexes of rats in three groups

注:UA=血尿酸，Scr=血肌酐;與正常組比較，△P＜0.05;與模型組比較，▲P＜0.05

組別 只數(shù) 體質量(g)3周 5周UA(μmol/L)3周 5周Scr(μmol/L)3周 5周正常組 12 332±16 428±24 81±10 78±13 26± 7 28± 8模型組 12 288±24△ 242±37△ 135±32△ 124±14△ 112±27△ 177±23△纈沙坦組 12 301±25△▲ 345±29△▲ 133±19△ 127±18△ 82±15△▲ 138±21△▲F 值＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 383.60 160.01 41.22 136.50 214.58 172.98 P值

表3 3組大鼠Masson染色面積比及HIF－1α和TSP－1表達比較 (x ± s，%)Table 3 Comparison of Masson staining and expression of HIF－1α，TSP－1 in three groups

圖5 3組大鼠TSP－1 mRNA相對表達量Figure 5 Comparison of levels of TSP－1 mRNA of rats in three groups

圖6 3組大鼠HIF－1α mRNA相對表達量Figure 6 Comparison of levels of HIF－1α mRNA of rats in three groups

3 討論

腎間質纖維化是各種腎臟疾病進行性發(fā)展的共同轉歸，尿酸性腎病也不除外。腎間質纖維化機制目前認為是多種細胞因子參與的復雜過程。近年來PTC丟失及組織缺氧在腎間質纖維化中的作用日益引起人們的重視。研究表明，以小管間質病變?yōu)橹鞯哪I臟疾病由于水腫、炎癥等會直接影響血流和氧的供應［5－6］。HIF－1是由 HIF－1α 和 HIF －1β 組成的異二聚體復合物，HIF－1α在低氧環(huán)境中穩(wěn)定表達［2］，是反映低氧狀態(tài)的敏感指標。本研究采用酵母和腺嘌呤建立尿酸性腎病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎臟HIF－1α表達水平明顯升高，表明尿酸性腎病大鼠腎臟存在缺氧狀態(tài)。

TSP－1是一種內源性的強烈抑制血管生成因子，且高表達于整個腎纖維化過程中［7］。本研究同時發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎臟TSP－1表達水平亦明顯升高，且與HIF－1α的表達水平呈正相關。腎間質纖維化機制可能與TSP－1表達增加進而抑制血管生成，PTC密度減少，組織缺氧狀態(tài)加重有關。尿酸可激活腎素－血管緊張素系統(tǒng) (RAS)，改變腎臟血流動力學，升高球內壓，并可直接促進腎臟纖維化進展［8］。血管緊張素受體拮抗劑 (ARB)因可降低血壓，減少尿蛋白而起到腎臟保護作用，臨床上常用于慢性腎臟病的治療［9－10］，但其分子機制尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ可降低PTC密度，ARB奧美沙坦可以改善PTC減少引起的組織缺氧［11］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，纈沙坦干預治療3周后，腎間質纖維化程度減輕，TSP－1、HIF－1α表達較模型組均有所降低;5周后腎間質纖維化程度明顯改善，TSP－1、HIF－1α表達較3周時升高，但均比模型組降低。本研究結果表明，尿酸性腎病大鼠腎間質纖維化與TSP－1表達增多導致微血管丟失，加重組織缺血缺氧有關。纈沙坦可能通過減少微血管丟失、改善腎臟缺氧狀態(tài)從而起到保護腎臟的作用。

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