紗布纖維可否在小鼠氣囊植骨模型中誘發炎性骨溶解的研究

萬 睿，李 平，周園東，張 健

人工關節置換術過程中術者需使用大量醫用紗布拭干組織及骨周圍滲血，以保證手術視野的清晰，但紗布纖維存在不同程度地遺留。紗布纖維為醫學非移植材料［1］，遺留在體內會產生異物反應，形成慢性肉芽腫［2］。無菌松動是人工關節置換術后最常見的中遠期并發癥，那么松動界膜中的炎癥反應與紗布纖維遺留引起的異物反應是否有相似的形成機制或共同的細胞因子參與，慢性肉芽腫中的巨噬細胞是否有分化為破骨細胞的潛能從而產生溶骨作用?本研究通過建立小鼠氣囊植骨模型［3］以檢驗紗布纖維引起的囊壁組織及移植骨炎癥反應的相關因子的水平［4］，觀察紗布纖維是否會誘發炎性骨溶解，為優化手術操作奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 脛骨標本 經醫學倫理委員會批準后，選擇2011年3—4月4例在我院行膝關節置換術患者丟棄的脛骨上端松質骨作為脛骨標本，將每例患者的脛骨標本分為2塊，1塊采用干紗布擦拭 (干紗布組)，另1塊采用0.9%氯化鈉溶液浸濕的濕紗布擦拭 (濕紗布組)，擦拭壓力、方向及次數均相同，之后按照標準程序進行處理。

1.1.2 實驗動物 近交系SPF級BALB/c小鼠30只，雌雄各半，周齡8～10周，雌雄分開喂養。采用簡單隨機分組法將小鼠分為對照組、聚乙烯組和紗布組，每組10只。實驗動物由重慶醫科大學實驗動物中心提供，處置方法嚴格按照動物倫理委員會要求。

1.1.3 主要試劑 (1)聚乙烯顆粒:超高分子聚乙烯購自美國強生DePuy公司并由美國BioEngeering Solutiongs公司制備成直徑為8 μm的顆粒，經環氧乙烷消毒滅菌后配置成1%質量濃度的0.9%氯化鈉溶液混懸液備用。(2)紗布纖維:醫用脫脂棉紗布塊購自云南象山醫用材料有限公司，剪碎后經超聲細胞破碎機粉碎，人工分揀、稱量、高溫蒸氣滅菌、干燥后備用。(3)抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)試劑盒購自南京建成科技有限公司;兔抗小鼠白介素 (IL) －1β單克隆抗體、兔抗小鼠IL－6單克隆抗體、兔抗小鼠腫瘤壞死因子α(TNF－α)單克隆抗體、SP－0023免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司;二氨基聯苯胺 (DAB)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司;小鼠TNF－α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，購自美國R＆D公司;Trizol試劑購自美國Life Technologies公司;逆轉錄試劑盒、定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒均購自上海 (東洋紡)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立模型 (1)第1天，取小鼠背部正中線上1.5 cm處為進針點，去毛、消毒，皮下注射空氣2.5 ml，第3天再次注射空氣1 ml，氣囊形成。(2)第9天，每組選取2只小鼠使用頸椎脫臼法處死，取顱骨并分離周圍組織 (不損傷骨表面)，將顱骨分割成4 mm×3 mm大小骨片，置入0.9%氯化鈉溶液中備用，作為該組其他小鼠植骨供體;每組其他小鼠采用3.5%水合氯醛進行腹腔麻醉，然后在氣囊上切開一個5 mm長的切口，植入備好的顱骨骨片，使用0號絲線縫合切口，1∶100青鏈霉素溶液0.3 ml注射至氣囊預防感染。由于紗布纖維無法通過注射器注射入氣囊，因此，紗布組小鼠在顱骨骨片植入后即植入5 mg干重的紗布纖維。(3)第10天，聚乙烯組小鼠氣囊內注入含聚乙烯顆粒5 mg的混懸液0.5 ml，對照組小鼠氣囊內注入0.9氯化鈉溶液0.5 ml;以上步驟均嚴格按照無菌原則操作。(4)第17天，處死全部小鼠，取囊壁組織，石蠟包埋，液氮保存，骨片經10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液脫鈣。

1.3 觀察指標

1.3.1 電鏡觀察 干紗布組和濕紗布組各選取4個視野，采用日立S－3000N掃描電鏡進行拍照，Image－Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，計算紗布纖維覆蓋率。

1.3.2 肉眼觀察 小鼠處死前活動情況、死亡情況及處死后切口炎癥反應情況。

1.3.3 蘇木素－伊紅 (HE)染色 采用HE染色法觀察囊壁組織單核細胞計數和淋巴細胞計數，計數5個高倍視野，取平均值。參考文獻 ［5］中的方法確定炎癥反應程度，即陰性(－)、陽性 (+)、強陽性 (++)。

1.3.4 TRAP染色 骨片行石蠟切片，切片厚度為4 μm，按照試劑盒說明書進行染色;以破骨細胞胞質出現紫紅色顆粒為陽性，通過圖像分析軟件計算紫紅色胞質所占視野面積百分比，每個標本采集2個中倍鏡視野取平均值。

1.3.5 免疫組織化學染色 囊壁組織經固定后行石蠟切片，切片厚度為4 μm，常規脫蠟水化，抗原修復采用微波爐法;以IL－1β、IL－6、TNF－α單克隆抗體分別進行免疫組織化學染色，每個標本采集2個中倍鏡視野取平均值。通過圖像分析軟件計算各因子蛋白表達水平，以平均光密度值表示。

1.3.6 ELISA 將液氮保存的囊壁組織于勻漿器中勻漿，取上清液檢測TNF－α水平。

1.3.7 實時定量PCR 由于經費限制，每組采用簡單隨機法選取3只小鼠進行檢測。取100 mg囊壁組織加入Trizol試劑，于勻漿器中勻漿，常規提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，按照試劑盒說明書檢測TNF－α mRNA表達水平。TNF－α上游引物為5'－CGGGCAGGTCTACTTTGGAG－3'，下游引物為5'－CAGGTCACTGTCCCAGCATC－3'，擴增片段長度為230 bp;以β－actin為內參照，上游引物為5'－CTGAGAGGGAAATCGTGCGT－3'，下游引物為5'－CCACAGGATTCCATACCCAAGA－3'，擴增片段長度為208 bp，引物合成由美國Life Technologies公司完成。擴增條件:預變性:95℃，1 min;循環 (40次):95℃，15 s，58℃，20 s，72℃，20 s;末段延伸:72℃，5 min;溶解曲線:72～95℃，每20 s升溫1℃。結果處理采用ΔΔCT法，TNF－α mRNA 表達倍數 =2－K，K=(CT樣本目的基因－CT樣本內參基因) － (CT對照目的基因－ CT對照內參基因)。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料以 (±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗;多組間等級資料比較采用秩和檢驗，兩兩比較采用Mann－Whitney U檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電鏡觀察 干紗布組纖維覆蓋率為 (18.11±6.94)%，濕紗布組為 (4.86±3.64)%，兩組比較差異有統計學意義 (t=3.38，P ＜0.05，見圖1)。

2.2 肉眼觀察 各組小鼠處死前活動情況良好，無死亡小鼠;處死后發現，聚乙烯組和紗布組小鼠切口存在不同程度的炎癥反應，表現為紅斑及水腫，對照組小鼠無明顯炎癥反應。

2.3 HE染色 各組小鼠囊壁組織炎癥反應程度比較，差異有統計學意義 (P＜0.05，見表1)。其中，紗布組和聚乙烯組小鼠單核細胞反映的炎癥反應程度(U紗布組vs.對照組=6.00，U聚乙烯組vs.對照組=4.00)、 淋巴細胞反映的炎癥反 應 程 度(U紗布組vs.對照組=3.50，U聚乙烯組vs.對照組=7.00) 與對照組小鼠比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05);紗布組小鼠與聚乙烯組小鼠單核細胞反映的炎癥反應程度 (U=28.00)、淋巴細胞反映的炎癥反應程度 (U=28.00)比較，差異均無統計學意義 (P＞0.05)。

圖1 干紗布組和濕紗布組電鏡觀察結果 (×30)Figure 1 Result of SEM between dry sponge group and wet sponge group

表1 各組小鼠囊壁組織炎癥反應程度比較 (只)Table 1 Comparison of inflammation reaction of air pouch wall tissue in each group

2.4 TRAP染色 各組小鼠TRAP染色陽性面積比較，差異有統計學意義 (P＜0.05，見圖2、表2)。其中，紗布組和聚乙烯組小鼠與對照組小鼠比較，差異均有統計學意義(t紗布組vs.對照組=4.93，t聚乙烯組vs.對照組=5.41，P ＜ 0.05); 紗布組小鼠與聚乙烯組小鼠比較，差異無統計學意義 (t=0.48，P＞0.05)。

2.5 免疫組織化學染色 各組小鼠囊壁組織IL－1β、IL－6、TNF－α蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義 (P＜0.01，見圖3、表2)。其中，紗布組和聚乙烯組小鼠IL－1β蛋白表達水平 (t紗布組vs.對照組=6.42，t聚乙烯組vs.對照組=5.77)、IL －6 蛋白表達水平 (t紗布組vs.對照組=7.01，t聚乙烯組vs.對照組=5.90)、TNF － α蛋白表達水平 (t紗布組vs.對照組=15.26，t聚乙烯組vs.對照組=10.56) 與對照組小鼠比較，差異均有統計學意義 (P＜0.05);紗布組小鼠與聚乙烯組小鼠TNF－α蛋白表達水平比較，差異亦有統計學意義 (t=4.70，P＜0.05)，而IL－1β、IL－6蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義 (t值分別為1.17和1.12，P＞0.05)。

2.6 ELISA 各組小鼠囊壁組織TNF－α水平比較，差異有統計學意義 (P＜0.01，見表2);各組兩兩比較 (t紗布組vs.對照組=35.10，t聚乙烯組vs.對照組=25.09，t聚乙烯組vs.紗布組=10.01)，差異均有統計學意義 (P＜0.05)。

2.7 實時定量PCR 對照組小鼠TNF－α mRNA表達倍數為(1.06±0.50)、聚乙烯組為 (3.29±0.16)、紗布組為 (4.15±0.18)，各組小鼠TNF－α mRNA表達倍數比較，差異有統計學意義 (F=375.31，P＜0.001);各組兩兩比較(t紗布組vs.對照組=26.54，t聚乙烯組vs.對照組=19.16，t聚乙烯組vs.紗布組=7.38)，差異均有統計學意義 (P＜0.05)。

表2 各組小鼠顱骨骨片TRAP染色陽性面積、囊壁組織各細胞因子平均光密度值及囊壁組織TNF－α水平比較 (±s)Table 2 Comparison of positive area of calvarial TRAP staining，AOD of each cytokine and TNF－α levels in air pouch wall tissue in each group

表2 各組小鼠顱骨骨片TRAP染色陽性面積、囊壁組織各細胞因子平均光密度值及囊壁組織TNF－α水平比較 (±s)Table 2 Comparison of positive area of calvarial TRAP staining，AOD of each cytokine and TNF－α levels in air pouch wall tissue in each group

注:TRAP=抗酒石酸酸性磷酸酶，IL－1β=白介素1β，IL－6=白介素6，TNF－α=腫瘤壞死因子α

組別 只數 TRAP染色陽性面積(%)平均光密度值IL－1β IL－6 TNF－α TNF－α水平(pg/ml).005 88.52±1.59聚乙烯組 8 5.27±1.53 0.145±0.013 0.105±0.020 0.169±0.015 144.32±4.94紗布組 8 4.90±2.09 0.152±0.014 0.114±0.015 0.199±0.018 166.58±5.69 F對照組 8 1.16±0.45 0.115±0.006 0.057±0.013 0.099±0值＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 17.93 23.39 28.40 122.22 653.97 P值

圖2 各組小鼠顱骨骨片TRAP染色結果 (×200)Figure 2 Result of mice calvarial TRAP staining in each group

圖3 各組小鼠囊壁組織免疫組織化學染色結果 (×100)Figure 3 Result of Immunohistochemical staining of air pouch wall tissue in each group

3 討論

在假體磨碎碎屑中，數量最多的當屬聚乙烯顆粒［6］，是公認的生物活性最強的碎屑顆粒，因此，本研究以聚乙烯顆粒為參考，作為確定能引起炎性骨溶解的“金標準”，以確定紗布纖維是否能引起相同的炎性骨溶解。

在人工關節無菌性松動中，磨損碎屑引起的巨噬細胞、成纖維細胞分泌的大量的炎性遞質是假體周圍骨溶解的“導火索”。研究表明，炎性遞質IL－1β、IL－6、TNF－α主要是促進破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化成熟進而產生溶骨作用，該過程主要通過破骨細胞“OPG/OPGL(RANKL)/RANK”信號轉導通路完成。OPGL通過與破骨細胞前體細胞膜上的RANK結合，導致破骨細胞前體細胞向破骨細胞分化成熟，而OPG作為OPGL的偽受體與之結合而抑制破骨細胞的分化成熟［7］。IL－1β和TNF－α能直接促進OPGL的生成增多，從而使更多的破骨細胞成熟，產生骨溶解效應［8］。IL－6促進破骨細胞的成熟的同時還能作用于巨噬細胞本身，使其產生更多的IL－6而引起骨溶解效應［9］。因此，本研究選擇 IL－1β、IL－6、TNF－α作為骨溶解效應的標志。

本研究采用的動物模型是人工關節無菌性松動研究中經典的病理模型，能較好地模擬人工關節松動的病理過程，且成本低、周期短、可重復性高［10］，較為理想。

無菌性松動通常發生在骨與假體間的界膜或假體表面，異物顆粒可見于組織細胞或巨細胞胞質內或細胞外，常伴有不同程度的淋巴細胞浸潤［11－13］。界膜組織中，單核巨噬細胞約占70%，當其吞噬周圍磨損碎屑后，會釋放大量的炎性遞質如IL－1β、IL－6、TNF－α等，界膜組織中的多核巨細胞和成纖維細胞也會促進炎性遞質釋放［14－15］。有研究表明，界膜組織實質就是以巨噬細胞為主，多種細胞共同參與的異物肉芽腫性炎［16］。松動假體周圍的結締組織膜具有異物肉芽腫的特征，異物所致慢性肉芽腫主要是以滲出的單核細胞與巨噬細胞為主，包含異物巨細胞［17］。Udagawa等［18］研究發現，界膜中的破骨細胞在抗原和功能上均與成熟巨噬細胞相似，并可在合適的刺激因子作用下由巨噬細胞前體衍化生成。因此，筆者聯想到紗布纖維引起的異物反應與常見的無菌性松動的界膜炎癥反應有著很多相似之處，異物反應中的巨噬細胞有可能在某些微環境作用下成為破骨細胞進而產生骨溶解效應。

本研究首先模擬紗布擦拭骨表面的真實過程，確定了術中紗布纖維殘留的可能性，且干紗布造成的殘留量高于濕紗布，而小鼠實驗結果提示紗布纖維可引起氣囊內炎性因子的釋放增加，減少紗布纖維的殘留對減少炎性因子導致的炎性骨溶解有直接作用。而將與聚乙烯顆粒等重量的紗布纖維植入小鼠氣囊后，聚乙烯組和紗布組小鼠囊壁組炎癥反應程度、炎性細胞滲出量、蛋白表達水平、炎性遞質mRNA及顱骨骨片破骨細胞特異性染色程度均強于對照組小鼠，且紗布組TNF－α蛋白表達水平高于聚乙烯組，說明紗布纖維與聚乙烯顆粒一樣，可引起假體周圍組織炎性因子的釋放增加，產生炎性骨溶解。但紗布組和聚乙烯組小鼠HE染色、TRAP染色及免疫組化染色結果并無顯著性差異，且本研究中采用的動物數量較少，斷然做出紗布纖維較聚乙烯顆粒的生物活性更強的結論有些欠妥，其具體的更深入的作用機制有待于進一步研究。

綜上所述，術中使用紗布要慎重，尤其應避免使用干紗布，以免留下大量的紗布纖維。建議使用濕紗布以減少纖維的殘留，或采用新型表面干燥措施。

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