苦參堿對肝癌細胞增殖及其細胞自噬的影響

范 悅 王世明 石青青

山西醫科大學第一醫院普通外科，山西太原 030001

在中國傳統醫藥中，苦參堿是一種從苦參、山豆根中提取的生物堿，其分子式為C15H24N2O。而苦參堿早被廣泛用于治療病毒性肝炎、肝纖維化、心律失常等疾病[1]。國內外研究表明[2]：無論是在體內還是體外，苦參堿具有較高的抗腫瘤活性。它可以抑制腫瘤增殖、誘導分化、誘導凋亡、抗轉移等作用，同時又具有免疫調節、升高白細胞、緩解癌痛等許多常規化療藥物所不具備的優勢。此外，研究發現苦參堿誘導了大鼠C6膠質瘤細胞的自噬[3]。而自噬與腫瘤關系密切，同樣在抑制腫瘤中起著非常重要的作用[4-5]。細胞自噬在輔助化療藥物治療惡性腫瘤方面起著非常重要的作用。本實驗通過研究不同濃度的苦參堿作用于肝癌HepG2細胞，探討苦參堿對肝癌HepG2細胞細胞周期以及細胞自噬的影響，為臨床化療藥物治療肝癌提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

肝癌HepG2細胞由北京協和醫學院提供。苦參堿（Matrine，廣州白云山明興制藥有限公司）、DMEM 4.5 g/L Glu（Gibco公司）、PBS 液、胎牛血清（美國 Sigma公司）、單丹磺酞戊二胺（MDC）（美國Sigma公司）、二甲基亞砜（DMSO）、熒光顯微鏡（日本 OlympuS公司）、CO2培養箱、離心機（北京醫用離心機廠）、流式細胞儀（美國BD公司，型號：FACSCalibur）、電熱恒溫培養箱 （河北省黃石市醫療器件廠）等。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 將肝癌HepG2細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養液的培養瓶中，在37℃、5%CO2、飽和濕度下常規培養。顯微鏡下觀察細胞貼壁達80%時，用胰酶消化處理，取對數期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法 肝癌HepG2細胞用0.25%胰酶處理制成單細胞懸液，以每孔約104個細胞接種于96孔板（每孔100μL）。分別加入不同濃度的苦參堿溶液，使其終濃度為0.5、1.0、2.0 mg/mL，每個濃度設三個孔。然后在加培養液100 μL，每孔總體積為200 μL，同時設定空白孔及對照孔。然后放回CO2箱中培養24、36、48 h。分別在各個時間段結束前4 h加入 MTT（5 mg/mL）溶液 10 μL，反應 4 h離心棄上清液。每孔加入DMSO 150 μL振蕩蕩5～10 min。用酶標儀測定波長為490 nm的吸光值。根據公式計算：腫瘤細胞增值抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.3 流式細胞術分析細胞周期 肝癌HepG2細胞以5×104/mL接種至6孔板中，細胞貼壁后，分別加入0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL的苦參堿，培養36 h后，收集細胞，并用流式細胞儀行細胞周期分析。

1.2.4 單磺酰戊二胺 （monodansylcadaverine，MDC）熒光染色 將DMEM液培養的肝癌HepG2細胞以1×104/mL接種至12孔板中，待細胞貼壁后，分別加入0.5、1.0、2.0 mg/mL的苦參堿，培養36 h棄培養液，用PBS液洗2遍，加入50 μmol/L MDC，37℃孵育10 min染色。 再用 PBS漂洗細胞3次，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 苦參堿顯著抑制肝癌HepG2細胞的增殖

MTT測定結果見圖1，苦參堿顯著抑制肝癌HepG2細胞的增殖，并呈現時間-劑量依賴性。見表1。苦參堿0.5、1.0、2.0mg/mL作用于肝癌HepG2細胞36 h后的抑制率分別：（17.21±2.02）%、（28.25±3.20）%、（38.77±5.58）%。

表1 不同濃度苦參堿作用于肝癌HepG2細胞不同時間的抑制率（±s，%）

表1 不同濃度苦參堿作用于肝癌HepG2細胞不同時間的抑制率（±s，%）

注：同一濃度不同時間比較，P<0.05；同一時間不同濃度比較，P<0.05

濃度 24 h 36 h 48h 0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 2.0 mg/mL 12.48±1.22 20.57±2.21 31.58±2.26 17.21±2.02 28.25±3.20 38.77±2.58 24.47±2.20 40.12±2.37 46.76±3.24

2.2 流式細胞儀檢測結果

不同濃度苦參堿作用于肝癌HepG2細胞36 h后，流式細胞儀分析細胞周期見表2。結果所示：不同濃度苦參堿作用于肝癌HepG2細胞中36 h后，G1期細胞增多，S期細胞減少，呈現劑量依賴性。結果表明苦參堿將肝癌HepG2細胞阻滯在細胞周期的G1期。

表2 不同濃度的苦參堿作用于肝癌HepG2細胞36 h后細胞周期（±s）

表2 不同濃度的苦參堿作用于肝癌HepG2細胞36 h后細胞周期（±s）

注：同一時間不同濃度組之間，分別比較G1期和S期P<0.05，而G2/M期P>0.05

濃度 G1期 S期 G2/M期0.5 mg/mL 1.0 mg/mL 2.0 mg/mL 37.23±1.72 39.42±1.74 42.66±1.35 35.34±2.16 35.26±0.87 34.75±1.27 15.02±1.35 15.36±1.47 14.92±2.03

2.3 MDC染色顯示苦參堿誘導肝癌HepG2細胞自噬的產生

為了研究苦參堿是否誘導了肝癌HepG2細胞自噬的產生，本文用熒光鏡觀察MDC染色的肝癌HepG2細胞，細胞顯著的形態學變化如圖2所示。MDC是自噬泡的特異性標記物熒光顯微鏡下觀察細胞時，胞質內可見到清晰的點泡狀結構，表明苦參堿誘導了自噬 的產生。

3 討論

原發性肝癌是惡性程度最高的腫瘤之一。全球男性發病率位于惡性腫瘤的第5位，死亡率居惡性腫瘤的第2位；全球女性發病率位于第7位，死亡率位于第6位。全球每年新發肝癌約75萬人，而我國占半數以上[6]。由于肝癌具有惡性程度高、病情發展快、預后差、死亡率高等特點，多數就診時已屬晚期。目前手術治療依然是肝癌的首選，但是肝癌發病隱匿，確診時能手術者僅占l0%～15%，因此必須聯合其他非手術措施（如化療、生物治療等）進行綜合治療，才能有望提高肝癌患者的長期生存率[7]。近年來，苦參堿作為一種新型化療藥物，具有療效顯著、副作用小、毒性低等特點應用于臨床。

苦參堿（Matrine）是中藥苦參、山豆根、苦豆子的主要活性成分，具有保護肝細胞、抗病毒、抗過敏等多種藥理作用[8]。此外苦參堿具有廣泛的抗腫瘤作用。研究發現：在體外實驗中苦參堿可明顯地誘導人乳腺癌[9]、骨肉瘤[10]及肝癌細胞[11]等的凋亡。苦參堿的抗腫瘤的作用機制很多，主要包括誘導腫瘤細胞凋亡、誘導腫瘤細胞分化、誘導細胞自噬以及細胞毒等多種作用[3，12-13]。本實驗結果表明：苦參堿對人肝癌HepG2細胞有明顯的抑制作用，不同濃度的苦參堿作用不同時間后，肝癌細胞的存活率降低，這種抑制作用呈時間和劑量依賴性。流式細胞儀分析細胞周期結果：苦參堿作用于人肝癌HepG2細胞后，G1期細胞數目明顯增多，S期細胞數目減少（P<0.05），這表明苦參堿作用肝癌細胞后將細胞周期阻滯在G1期，使細胞不能進入S期進行DNA合成，并最終抑制了肝癌HepG2細胞的抑制，本文實驗結果與以往郭丹等[14]、夏寶妹等[15]、楊道科等[16]在肝癌、子宮內膜癌以及結腸癌細胞中的研究結果一致。同時熒光顯微鏡檢測：苦參堿誘導肝癌HepG2細胞自噬泡的產生，這表明自噬參與了苦參堿抑制肝癌HepG2細胞的增殖，可能提示苦參堿作用于肝癌HepG2細胞后，自噬多發生在細胞周期的G1期。而自噬作為一把雙刃劍，它與腫瘤之間的關系錯綜復雜，既可以促進腫瘤的生長，也可以誘導腫瘤的生長，在本實驗研究中認為它參與了苦參堿抑制肝癌細胞的增殖。本文在既往研究的基礎上，探討了苦參堿對人肝癌HepG2增殖及其細胞自噬的影響，而其發生的信號通路及其作用機制仍需作進一步的研究。希望本實驗研究能為細胞周期與腫瘤的增值、分化等之間的關系提供研究基礎，為臨床進一步更好的治療肝癌提供理論基礎。

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