氯化血紅素對大鼠肺微血管內皮細胞氧化損傷的保護作用

宗俊青 馬 捷

1.山西醫科大學，山西太原 030001；2.山西醫科大學第二醫院心胸外科，山西太原 030001

氯化血紅素對大鼠肺微血管內皮細胞氧化損傷的保護作用

宗俊青1馬 捷2▲

1.山西醫科大學，山西太原 030001；2.山西醫科大學第二醫院心胸外科，山西太原 030001

目的 探討氯化血紅素（hemin）對過氧化氫（H2O2）誘導大鼠肺微血管內皮細胞（PMVECs）氧化應激損傷的保護作用。 方法①應用SD雄性大鼠的肺組織，進行大鼠PMVECs的原代培養并傳代培養；通過倒置顯微鏡觀察其形態，Ⅷ因子相關抗原免疫熒光鑒定。②應用H2O2構建PMVECs氧化應激損傷模型，并用hemin與H2O2共同孵育PMVECs。③采用MTT比色法檢測各組細胞活力變化，用比色法檢測內皮細胞培養上清液中乳酸脫氫酶（LDH）的含量，Western-blot檢測各組內皮細胞微管相關蛋白1輕鏈3（LC-3）含量。 結果 ①體外培養的大鼠PMVECs呈梭形或多角形，形成單層后呈典型的鵝卵石樣或鋪路石樣排列，免疫熒光檢測FITC標記的Ⅷ相關抗體呈陽性，陽性率90%以上，成功建立了PMVECs的原代培養方法；②H2O2使內皮細胞活力下降，且呈劑量依賴性，200 μmol/L H2O2內皮細胞活力下降50%左右；③H2O2組LDH含量均高于hemin組及正常對照組（P＜0.05），hemin組LC-3的表達顯著低于H2O2組。 結論 低濃度hemin對H2O2誘導的PMVECs氧化應激損傷有保護作用，這種作用可能與hemin抑制H2O2誘導內皮細胞過度自噬有關。

氯化血紅素；肺微血管內皮細胞；過氧化氫；自噬

肺損傷常發生在體外循環、心肺聯合移植、肺切除、肺栓塞、復張性肺水腫、休克及心肺復蘇等多種臨床情況下。在各種原因引起的肺損傷中，肺微血管內皮細胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）是活性氧類的重要靶細胞之一。PMVECs構成半選擇性屏障，該屏障對于肺氣體交換，調節液體和可溶物在血液與肺間質之間的流動具有重要意義。雖然肺微血管內皮和肺大血管內皮之間有一定相似的功能和表型，但是并不完全相同。文獻報道微血管和大血管表型和功能有顯著不同[1]。因此，發現和探討一種新的保護PMVECs的方法，對治療內皮損傷以及由此引發的各種疾病具有重要意義。研究經證實低濃度的氯化血紅素（hemin）可誘導細胞產生血紅素氧合酶，從而起到抗氧化損傷及抗凋亡的作用。

近年來自噬（autophagy）的研究不斷升溫且研究也在逐漸深入。自噬是細胞將受損、變性的蛋白質以及損傷細胞器運輸到溶酶體進行消化降解，以胞質內出現自噬體為特征的細胞自我消化過程，是細胞應激情況下用來維持細胞內環境穩定和存活的重要機制[2-3]，同時過度的自噬也會對細胞有損傷作用最終使細胞凋亡。因此，對影響血管內皮細胞過度自噬相關因素的了解及其相關機制的研究，對維持血管內皮細胞的存活及功能有重要的作用。本實驗通過建立大鼠PMVECs體外培養模型，觀察H2O2在RPMVECs氧化應激損傷中的作用及hemin的保護作用，并對其自噬水平進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

內皮細胞特制培養體系（含500 ml基礎培養基，25 ml胎牛血清及5ml內皮細胞生長添加物和5 ml青霉素/鏈霉素）購于ScienCell公司；兔抗鼠Ⅷ相關抗原購于北京中杉金橋公司；低糖DMEM培養基購于Hyclone公司；FITC標記的羊抗兔IgG購于北京博奧森公司；特級胎牛血清購于GIBCO公司；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒為碧云天產品；二甲基亞砜（DMSO）、氯化高鐵血紅素購于Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG和兔抗鼠β-actin抗體購于中杉金橋公司；兔抗鼠內皮細胞微管相關蛋白1輕鏈 3（LC-3）B 抗體購于 Cell Signaling Technology（CST）公司。

1.2 內皮細胞的培養和鑒定

選重150～200 g健康SD雄性大鼠。10%的水合氯醛腹腔注射麻醉。將整個大鼠泡于75%的乙醇中5～10 s，在超凈工作臺上，剪下心肺組織放入盛有含青霉素和鏈霉素各100 U/ml的D-Hanks中沖洗。洗凈血跡。用眼科剪盡量剪去肺臟表面的臟層胸膜。剪成1 mm3大小的組織塊。將剪好的組織塊接種于25 cm2的無菌培養瓶中，將培養瓶倒置放入培養箱中，干貼壁2 h左右后，翻轉培養瓶加入約3 ml含20%血清的完全培養液。培養12～16 h時輕輕換液，以去除血細胞。繼續培養約40 h后取出組織塊，同時換液，繼續培養2～3 d待細胞融合成單層約80%時傳代。取用3～4代細胞進行后續實驗。內皮細胞鑒定采用免疫熒光法鑒定，抗體為兔抗鼠Ⅷ因子一抗和FITC羊抗兔二抗對細胞鑒定。

1.3 MTT法測定H2O2對內皮細胞的損傷

實驗分 5 組（對照組，H2O2100 μmol/L 組，H2O2200 μmol/L組，H2O2500 μmol/L 組，H2O2800 μmol/L 組），每組 6 個復孔，各組都孵育4 h后，棄去原培養基，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續培養 4 h，吸出原液。 加入 100 μl的 DMSO原液，振蕩10 min，待結晶完全溶解后用酶標儀于490 nm波長處測定吸光值（OD值），實驗重復3次。

1.4 乳酸脫氫酶的測定

實驗分 5 組（對照組，200 μmol/L H2O2組，2.5 μmol/L hemin+200 μmol/L H2O2組 ，5 μmol/L hemin+200 μmol/L H2O2組，10 μmol/L hemin+200 μmol/L H2O2組）取 2～4 代生長良好的內皮細胞，同步化12 h后。取上清液，按乳酸脫氫酶測試盒的方法測定培養液中的LDH釋放量。

1.5 細胞LC-3表達水平的測定

分組及處理同前，Western-blot測定各組細胞LC-3蛋白表達情況。提取各組細胞中的總蛋白，調整上樣量100 μg/孔，用5%濃縮膠和12%的分離膠電泳分離蛋白質，轉移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉后依次加入兔抗鼠 LC-3B 抗體（1∶1000）和兔抗鼠 β-actin 抗體（1∶1000）。4℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（1∶2500），洗膜后超敏發光液顯色。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，實驗數據均以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺微血管內皮原代細胞的鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察肺組織塊貼于培養瓶壁后，血細胞立即從肺組織塊邊緣向四周游出，24 h左右PMVECs游出，60 h左右去掉組織塊可以獲得只有少量血細胞和血管內皮細胞的混合物。原代細胞生長3～6 d后可融合形成細胞單層，細胞呈鵝卵石鑲嵌狀排列（圖1），再培養3 d時見有血管腔樣結構形成（圖2）。

圖1 大鼠PMVECs去除組織塊第5天（×100）

圖2 再培養3 d時見有血管腔樣結構形成（×200）

2.2 免疫熒光鑒定

Ⅷ因子相關抗原免疫熒光染色后細胞漿內有綠色熒光，證實所培養的細胞為內皮細胞（圖3）。

圖3 第3代肺微血管內皮細胞免疫熒光染色陽性（×200）

2.3 內皮細胞生長抑制率的比較

MTT測定半數抑制率，細胞抑制率隨H2O2濃度增大而增大（測3次取平均值）（表1）。

表1 內皮細胞生長抑制率的比較（%，±s）

表1 內皮細胞生長抑制率的比較（%，±s）

選取200 μmol/l H2O2作后續實驗

組別抑制率100 μmol/L H2O2 組200 μmol/L H2O2 組500 μmol/L H2O2 組800 μmol/L H2O2 組34.0±7.2 49.0±8.4 73.0±11.7 80.0±8.2

2.4 各組內皮細胞LDH的比較

H2O2組LDH釋放量較正常組明顯升高（P<0.05），經hemin處理后的內皮細胞LDH釋放量明顯低于H2O2組（P<0.05）（表 2）。

表2 各組內皮細胞LDH的比較（U/L，±s）

表2 各組內皮細胞LDH的比較（U/L，±s）

與對照組比較，#P<0.05，與 200 μmol/L H2O2組比較，*P<0.05

組別LDH對照組200 μmol/L H2O2 組200 μmol/L H2O2+2.5 μmol/L hemin 組200 μmol/L H2O2+5 μmol/L hemin 組200 μmol/L H2O2+10 μmol/L hemin 組71.31±11.54*516.45±20.59#446.77±26.19#*361.69±27.12#*307.14±17.35#*

2.5 Western-blot檢測細胞LC-3蛋白的表達

H2O2組LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ的表達量明顯高于對照組（P<0.05），經各濃度hemin組處理的內皮細胞蛋白LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ的量明顯低于H2O2組，且有一定的劑量依賴性（P<0.05）。5，10 μmol/L hemin 組 LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ表達量明顯低于2.5 μmol/L 組（P<0.05）（圖 4、表 3）。

圖4 Western-blot檢測細胞LC-3蛋白表達結果

表3 各組LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ蛋白表達情況的比較

3 討論

目前，用于血管內皮細胞培養的方法主要有酶消化法、組織塊法、機械刮取法等，其中酶消化法主要用于大血管內皮細胞的培養且常混有成纖維細胞、平滑肌細胞等雜細胞[4]。組織塊種植法培養大鼠PMVECs，因其簡便、高效而在國內應用較廣。本研究采用大鼠肺組織貼塊法成功地培養出PMVECs。通過應用內皮細胞專用培養基和加用肝素使內皮細胞純化，差速消化法等措施來防止雜細胞的污染。此法能避免機械損傷和化學損傷，且不需特殊設備，操作簡單。研究結果顯示培養5～7 d內皮細胞可達一定的細胞密度，融合成片狀，這與相關文獻[5-6]報道一致。通過組織塊的來源，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況、細胞形態以及免疫熒光鑒定證實，培養獲得的細胞為大鼠肺微血管內皮細胞。

自噬是指細胞內受損、變性或衰老的蛋白質和細胞器被運輸到溶酶體，溶酶體對其消化降解的過程。Ashford等[7]在小鼠肝細胞中觀察到細胞自噬現象。通常情況下細胞保持著輕度自噬以保持內環境的穩態，維持生存；但過度自噬會破會這種平衡使細胞死亡[8]。同時凋亡和自噬保持著動態平衡，即自噬可能為凋亡所需，自噬通常先于凋亡，進而啟動凋亡；自噬亦可能抑制凋亡作用，可保護細胞免于發生凋亡和壞死；自噬還可能向凋亡轉化，共同促進細胞死亡；以上都說明自噬與細胞生存有密切聯系。最近研究發現自噬在肺動脈高壓及乳腺癌中也起著重要作用[9-10]，同時越來越多的研究證實自噬在許多疾病的發生和發展中起著重要的作用。

自噬形成過程中，多種自噬相關基因（ATG）參與自噬泡的形成，而LC-3修飾過程對自噬泡的形成必不可少，均與自噬泡的形成息息相關。而LC-3Ⅱ是自噬體的標志分子。所以本實驗把LC-3Ⅱ作為評價自噬水平的標志分子。

hemin屬于血紅素的一種，目前發現其具有廣泛的生物學效應。有研究發現hemin可以降低原發性高血壓大鼠的血壓[11]，也可以減輕由于缺氧導致的肺動脈高壓[12]。Togane[13]等人發現hemin可以對抗球囊損傷模型對血管平滑肌的損傷。hemin對血管系統的保護作用機制未明確，可能與其誘導HO-1的合成有關。HO-1可以明顯的抑制炎癥因子MMP-9、IL-6和TNF-α等的表達。HO-1的抗炎作用很大程度上是由HO-1分解血紅素的產物一氧化碳介導的[14]。但是，其對H2O2誘導損傷的內皮細胞是否具有保護作用以及對細胞自噬水平的影響并不完全清楚。

H2O2能夠穿透細胞膜進入細胞，從而造成DNA鏈斷裂，導致細胞損傷以及使細胞凋亡[15]，過度的H2O2能誘導自噬性細胞死亡，H2O2誘導的自噬性細胞存活和死亡之間的關系仍待于進一步研究。本實驗中H2O2損傷組中LDH及LC3-Ⅱ含量均明顯升高，表明H2O2有引起內皮細胞損傷，抑制細胞的增殖代償的能力。同時可以誘導內皮細胞提高自噬活性。而用低濃度hemin處理可降低其LDH及LC-3Ⅱ含量，表明hemin可明顯減輕 H2O2引起的活性氧簇，對內皮細胞損傷有保護作用，而這種保護作用可能是與hemin抑制了內皮細胞的過度自噬有關。

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The protective effects of hemin against H2O2-induced rat pulmonary microvascular endothelial cells injury

ZONG Jun-qing1MA Jie2▲

1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Department of Cardiothoracic Surgery,the Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China.

ObjectiveTo study the protective effects of hemin against H2O2-induced rat pulmonary microvascular endothelial cells(PMVECs)oxidative stress injury.Methods①The modified tissue block pasted culture method was used to isolate and culture male Sprague-Dawley rat PMVECs.The morphous of cultured cells were observed by microscopy.The cultured cells were identified by immunofluorescence staining of factorⅧ related antigen.②To establish the rat PMVECs oxidative stress injury modle by H2O2treatment.Rat PMVECs were incubated with hemin and H2O2.③cell viability was detected by MTT assay.Levels of lactate dehydrogenase(LDH)were measured by supernatant,western-blot was used to evaluate LC-3 protein expression.Results①The cultured PMVECs of rat in vitro showed fusiform shape or polygon,and the monolayer cultures displayed a typical cobblestone or paving-stone morphology,the PMVECs expressed factorⅧ associated antigen.②The viability of PMVEC could be reduce H2O2significantly in dose dependent manners,and reduced to 50%when treated with 200 μmol/L H2O2.③LDH content in H2O2group were higher than that of hemin group and normal control group(P<0.05),the expression of hemin group of LC-3 significantly lower than that of H2O2group Conclusion Hemin treatment can protect against H2O2induced injuries and this protection effects maybe relate to hemin reducing the endothelial cells excess autophagy.

Hemin;Pulmonary microvascular endothelial cells;H2O2;Autophagy

R-332

A

1674-4721（2013）08（c）-0006-04

宗俊青（1984-），性別：男；學歷：碩士研究生；研究方向：心肺保護

▲通訊作者：馬捷（1957-），性別：男；職稱：博士生導師；研究方向：微創心臟外科學

2013-04-10 本文編輯：魏玉坡）