miR-106b對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲功能的影響

饒玉梅 陳 剛 李留霞 余靜麗 李秀芳

1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南鄭州 450002；2.華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢 430030

miR-106b對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲功能的影響

饒玉梅1陳 剛2李留霞1余靜麗1李秀芳1

1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南鄭州 450002；2.華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢 430030

目的 研究miR-106b對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲功能的影響及作用機(jī)制。方法 SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-106b inhibitors和mimics，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，Transwell及劃痕法檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲功能，分析E-cadherin、PTEN、p-AKT（Ser473）蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 miR-106b inhibitors和mimics改變SiHa細(xì)胞中 miR-106b表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR-106b inhibitors后，細(xì)胞遷移數(shù)、移動(dòng)距離減少（P<0.05）；PTEN及E-cadherin表達(dá)增強(qiáng)，p-AKT表達(dá)降低。轉(zhuǎn)染miR-106b mimics后，細(xì)胞遷移數(shù)、移動(dòng)距離增加（P<0.05）；PTEN及E-cadherin表達(dá)降低，p-AKT表達(dá)增強(qiáng)。 結(jié)論 miR-106b可能通過(guò)E-cadherin/AKT、PTEN/AKT信號(hào)通路影響SiHa細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲功能。

miR-106b；宮頸癌；轉(zhuǎn)移；PTEN；E-cadherin

宮頸癌是女性第三大惡性腫瘤[1]，盡管人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗、手術(shù)、放療、化療等綜合手段用于預(yù)防及治療宮頸癌，但許多患者最終死于腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。MicroRNA（miRNA）是一種只有21～25個(gè)堿基的非編碼小RNA，它可以通過(guò)降解mRNA和（或）抑制翻譯，于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá)，發(fā)揮多種生物學(xué)功能，包括對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲惡性表型的影響[2-3]。有研究顯示miR-143、miR-205、miR-106b等多種miRNA在宮頸癌中表達(dá)失調(diào)[4-6]。miR-106b在結(jié)腸癌、頭頸部鱗癌、食管癌中高表達(dá)，并影響它們的轉(zhuǎn)移侵襲等功能[7-9]。盡管其在宮頸癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)受HPV的E6、E7的調(diào)節(jié)[10]，但其對(duì)宮頸癌的生物學(xué)行為的影響目前未見(jiàn)報(bào)道，因此本文旨在研究其對(duì)宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌細(xì)胞SiHa購(gòu)自美國(guó)ATTC。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。脂質(zhì)體2000購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司。Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD Co.公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó) Costar，Corning Inc.公司。 miR-106b inhibitors、mimics 以及陰性對(duì)照購(gòu)自美國(guó)Dharmacon公司。E-cadherin、PTEN、p-AKT（Ser473）、β-actin 購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司。 Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。miR-106b反轉(zhuǎn)錄引物及實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan MicroRNA試劑盒、U6 snRNA購(gòu)自廣州銳博公司。

1.2 miR-106b inhibitors、mimics轉(zhuǎn)染 SiHa細(xì)胞

將SiHa細(xì)胞接種于6孔板中。按照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書進(jìn)行miR-106b inhibitors、mimics的轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)組命名為106b inhibitor和106b mimic，并設(shè)置陰性對(duì)照（inhibitor NC和 106b mimic NC）、空白對(duì)照（blank，即未轉(zhuǎn)染的 SiHa細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染6 h后換新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)試驗(yàn)。Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3 Real-time PCR

應(yīng)用Trizol抽提總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用TaqMan MicroRNA試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 1 min變性，95℃15 s，60℃ 20 s，70℃15 s，40 循環(huán)，U6 為內(nèi)參照。 每一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Transwell實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)。小室的上室鋪Matrigel 50 μL，凝固后小室的上室加入含2×105細(xì)胞的100 μL培養(yǎng)液（不含血清），下室加入10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液0.5 ml，置孵箱培養(yǎng)24 h。取出膜，拭去膜上層細(xì)胞，甲醇固定，蘇木精染色，高倍鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。取3個(gè)不同視野計(jì)數(shù)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞達(dá)95%融合度時(shí)，用小移液器滴頭劃痕。PBS洗3次。標(biāo)記，改用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)，Nikon倒置顯微鏡鏡下記錄劃痕寬度并拍照。24 h后觀察劃痕愈合情況。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

收獲各組細(xì)胞，加入100 μl，4℃的細(xì)胞裂解液裂解，于10 000×g 4℃下離心10 min。Bicinchoninic acid法測(cè)定蛋白濃度。取100 μg總蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜（PVDF膜）；5%脫脂奶 37℃封閉 1 h，加入 E-cadherin（1∶500）、PTEN（1∶1000）、p-AKT（1∶1000）、β-actin（1∶1000）一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，加入相應(yīng)的二抗，常溫孵育1 h，最后NBT/BCIP顯色拍照。蛋白條帶以β-actin為參照，利用灰度分析法測(cè)其相對(duì)蛋白含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-106b inhibitors、mimics轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

miR-106b inhibitors抑制細(xì)胞中miR-106b的表達(dá)，與陰性對(duì)照組相比miR-106b表達(dá)下降約3倍（0.32±0.03）（P<0.05）；miR-106b mimics顯著增強(qiáng) miR-106b 的表達(dá)，上升約 4倍（4.26±0.06）（P<0.05）。 而對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)

blank、mimics NC、106b mimics、inhibitor NC、miR-106b inhibitor 組 遷 移 細(xì) 胞 數(shù) 分 別 為 66.26±6.63、70.26±7.31、126.58±8.33、62.48±6.72、38.72±4.33。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-106b mimics后，其侵襲能力明顯增強(qiáng)；轉(zhuǎn)染miR-106b inhibitors后，其侵襲能力受到明顯抑制（P<0.05），而對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)

blank、mimics NC、106b mimics、inhibitor NC、miR-106b inhibitor組細(xì)胞移動(dòng)距離分別為：（52.31±4.97）、（51.37±5.85）、（94.00±7.94）、（52.73±4.11）、（31.06±3.54）μm。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-106bmimics后，其運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-106b inhibitors后，其運(yùn)動(dòng)能力受到明顯抑制（P<0.05），而對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 Western blot檢測(cè)

細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-106b inhibitors后p-AKT表達(dá)受到抑制，下降約2倍（陰性對(duì)照vs實(shí)驗(yàn)組為0.87±0.07 vs 0.42±0.03，下同），E-cadherin、PTEN 表達(dá)增強(qiáng)約 2 倍（前者為0.17±0.02 vs 0.38±0.03，后者為 0.48±0.05 vs 0.95±0.04）；轉(zhuǎn)染miR-106b mimics后，情況相反，即p-AKT表達(dá)增強(qiáng)約2倍（0.80±0.04 vs 1.52±0.06），E-cadherin 表達(dá)幾乎測(cè)不出，PTEN 表達(dá)下降約 2 倍（0.49±0.03 vs 0.21±0.02）（P<0.05）（圖 1）。

圖1 Western blot檢測(cè)SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-106b inhibitors、mimics及對(duì)照前后E-cadherin、PTEN、p-AKT的表達(dá)

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要標(biāo)志，臨床中約90%以上的患者死于腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[11]。因此，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行研究尤為重要。miR-106b編碼基因定位于染色體7q22.1，在宮頸癌中高表達(dá)，其表達(dá)還受HPV的E6、E7蛋白的調(diào)節(jié)，而HPV是宮頸癌的致病因素[12]，因此推測(cè)其在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究顯示，miR-106b對(duì)宮頸癌細(xì)胞SiHa的轉(zhuǎn)移侵襲表型具有促進(jìn)作用。當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-106b的inhibitors及mimics后，運(yùn)用劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，其在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)降低，能抑制宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲，增強(qiáng)其表達(dá)時(shí)，作用相反。

本研究進(jìn)一步檢驗(yàn)了改變宮頸癌細(xì)胞中miR-106b的表達(dá)時(shí)，E-cadherin、PTEN、p-AKT蛋白的表達(dá)情況。根據(jù)TargetScan、Pictar及Mirnada等數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，PTEN有可能是miR-106b直接作用的靶基因，PTEN是一個(gè)重要的抑癌基因，其在許多腫瘤中表達(dá)減弱、缺失或突變。當(dāng)其表達(dá)降低時(shí)，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移功能，而增強(qiáng)表達(dá)時(shí)，對(duì)腫瘤的惡性行為有抑制作用[13]。p-AKT是PTEN基因下游調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)——蛋白激酶B（AKT）的磷酸化形式，其可以促進(jìn)細(xì)胞存活及侵襲運(yùn)動(dòng)功能[14]。本研究顯示，當(dāng)降低miR-106b的表達(dá)時(shí)，SiHa細(xì)胞中PTEN表達(dá)增強(qiáng)；而當(dāng)增強(qiáng)miR-106b的表達(dá)時(shí)，SiHa細(xì)胞中PTEN表達(dá)下降。因此可以推測(cè)，miR-106b有可能通過(guò)改變PTEN/AKT通路，影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲功能。

E-cadherin是一個(gè)重要的黏附分子，其對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及黏附功能具有重要作用。相對(duì)于正常組織，其在大多數(shù)腫瘤組織（如結(jié)腸、卵巢癌、宮頸癌）中顯示低表達(dá)、不均勻性表達(dá)，甚至顯示表達(dá)闕如，并且表達(dá)強(qiáng)度往往隨著腫瘤分化程度的下降而下降。有研究顯示在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中E-cadherin表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[15]；當(dāng)胰腺癌細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞的侵襲功能增強(qiáng)[16]。E-cadherin能夠通過(guò)EGFR激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能[17]。本實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)降低miR-106b的表達(dá)時(shí)，SiHa細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)增強(qiáng)；而當(dāng)增強(qiáng)miR-106b的表達(dá)時(shí)，SiHa細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)幾乎消失。據(jù)此可以推測(cè)，miR-106b有可能通過(guò)改變E-cadherin/AKT通路，影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲功能。

綜上所述，miR-106b在宮頸癌中高表達(dá)，其可能通過(guò)影響PTEN/AKT信號(hào)通路及E-cadherin/AKT通路，促進(jìn)SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲，這將為臨床診治宮頸癌及判斷預(yù)后提供新的思路和作用靶點(diǎn)。

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Effects of miR-106b on migration and invasiveness of cervical cancer cells SiHa

RAO Yu-mei1CHEN Gang2LI Liu-xia1YU Jing-li1LI Xiu-fang1

1.Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,Tongji Hospital Affiliated to Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

ObjectiveTo explore the effect of miR-106b on migration and invasiveness of cervical cancer cells SiHa and its possible mechanism.MethodsmiR-106b inhibitors and mimics were transiently transfected into SiHa cells,and the expression of miR-106b was detected by real-time PCR.Then,the function of migration and invasion of cells and the expression level of E-cadherin,PTEN and p-AKT were detected by Transwell,wound-healing and Western blotting assay.ResultsThe expression of miR-106b was significantly altered by the miR-106b inhibitors and mimics in SiHa cells.Compared with negative control cells,knockdown of miR-106b expression dramatically decreased the number of cell invasion and the cell migration function(P<0.05).The expression of E-cadherin and PTEN were enhanced,but the p-AKT level was inhibited.On the contrary,compared with negative control cells,over expression of miR-106b significantly increased the cell invasion number and the cell migration function(P<0.05).The expression of E-cadherin and PTEN were decreased,but the p-AKT level was enhanced.ConclusionThe function of SiHa cells migration and invasion may be modulated by miR-106b through the signal pathway of E-cadherin/AKT and PTEN/AKT.

miR-106b;Cervical cancer;Metastasis;PTEN;E-cadherin

R737.3

A

1674-4721（2013）08（c）-0009-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（81272859）；鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院青年創(chuàng)新基金

饒玉梅（1974-），性別：女；學(xué)歷：博士；職稱：主治醫(yī)師；研究方向：婦科腫瘤

2013-07-03 本文編輯：魏玉坡）