纖維素酶輔助提取黃花蒿中青蒿素的工藝條件研究

盧婉怡

廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校制藥系，廣東廣州 510663

纖維素酶輔助提取黃花蒿中青蒿素的工藝條件研究

盧婉怡

廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校制藥系，廣東廣州 510663

目的 研究纖維素酶輔助提取青蒿素反應(yīng)中各條件對(duì)提取率的影響。 方法 采用紫外分光光度法測(cè)定青蒿素含量，研究酶反應(yīng)過(guò)程中時(shí)間、加酶量、溫度和pH值對(duì)提取率的影響，并使用正交實(shí)驗(yàn)方法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 纖維素酶輔助提取青蒿素的最優(yōu)工藝條件分別是：酶反應(yīng)時(shí)間2 h，纖維素酶用量0.30 g，酶反應(yīng)溫度45℃，酶反應(yīng)pH值4.5。結(jié)論 纖維素酶輔助提取青蒿素的方法能夠有效提高提取率。

青蒿素；纖維素酶；提取

青蒿素（artemisinin，C15H22O5）是治療瘧疾的特效藥，具有速效、高效和低毒等抗瘧性能[1]。目前，青蒿素主要從黃花蒿（Artemisia annua L.）中提取[2]。 近年來(lái)，用于天然產(chǎn)物提取的新技術(shù)如微波技術(shù)、酶技術(shù)等迅速涌現(xiàn)，并取得顯著的成效[3]。酶技術(shù)具有反應(yīng)效率高、條件溫和、專一性強(qiáng)和有效成分破壞少等優(yōu)點(diǎn)[4]，受到廣泛關(guān)注。

我國(guó)是黃花蒿的主產(chǎn)國(guó)，將酶技術(shù)應(yīng)用于青蒿素的提取過(guò)程，對(duì)提高提取效率、充分利用資源有重要意義。本研究對(duì)纖維素酶輔助提取青蒿素的條件進(jìn)行研究，分析各因素對(duì)提取率的影響，并采用正交實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)酶輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為纖維素酶在青蒿素提取工藝中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

青蒿藥材購(gòu)于廣州市清平中藥材市場(chǎng)（生產(chǎn)批號(hào)120711），經(jīng)鑒定為菊科植物黃花蒿的干燥地上部分，藥材經(jīng)粉碎后過(guò)40目篩備用。纖維素酶Cellulase T4（來(lái)源于綠色木霉Trichoderma viride，生產(chǎn)批號(hào)20120922）購(gòu)自天野酶制劑（上海）有限公司。青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品（生產(chǎn)批號(hào)A2118）購(gòu)自百靈威科技有限公司，無(wú)水乙醇、95%乙醇、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉等試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器設(shè)備

FW135型中藥粉碎機(jī)，SHA-2型恒溫水浴振蕩器，HH-4型恒溫水浴鍋，752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，SHZ-D型循環(huán)水真空泵。

1.3 方法

1.3.1 纖維素酶輔助提取青蒿素的方法

稱取1 g粉碎后的青蒿樣品置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，先常溫下浸泡10 min，再加入一定量的纖維素酶，然后在一定溫度下水浴振蕩進(jìn)行酶反應(yīng)。酶反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，將濾餅置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml無(wú)水乙醇，在45℃下水浴振蕩1 h，抽濾，取濾液測(cè)定青蒿素含量。

1.3.2 青蒿素含量的測(cè)定方法

青蒿素僅在紫外區(qū)203 nm處有較弱的末端吸收，但與堿反應(yīng)后，生成一化合物Q292，該物質(zhì)在292 nm處有最大吸收，可用紫外分光光度法檢測(cè)[5]。取樣品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml，再加入0.2%NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測(cè)定吸光值，每組測(cè)定3個(gè)平行樣品，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出青蒿素含量。

2 結(jié)果

2.1 青蒿素含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取青蒿素標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg，溶于95%的乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、1、2、3、4、5 ml， 加 95%的乙醇溶液至 5 ml，再加入 0.2%NaOH 20 ml定容至 25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測(cè)定吸光值，每組取3個(gè)平行樣品，取平均值。以青蒿素樣品濃度x（g/L）為橫坐標(biāo)，292 nm吸光值y為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。在292 nm下，青蒿素濃度在0～1 g/L的范圍內(nèi)，與吸光值呈良好的線性關(guān)系，表明測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠。

圖1 青蒿素含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)青蒿素提取的影響

按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纖維素酶，在45℃下水浴振蕩反應(yīng)，酶反應(yīng)緩沖液pH值為4.5，反應(yīng)時(shí)間分別為 1、2、3、4、5 h，測(cè)定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進(jìn)行提取的樣品中青蒿素含量為100%進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖2。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，青蒿素的提取率逐漸增加，在3 h左右達(dá)到最大值，再延長(zhǎng)提取酶反應(yīng)的時(shí)間，青蒿素的提取率基本不變。

2.3 不同加酶量對(duì)青蒿素提取的影響

按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中分別加入0.1、0.2、0.3、0.4g 纖維素酶，在 45℃下水浴振蕩反應(yīng)，酶反應(yīng)緩沖液pH值為4.5，反應(yīng)時(shí)間1 h，測(cè)定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進(jìn)行提取的樣品中青蒿素含量為100%進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著酶添加量的增加，青蒿素的提取率逐漸增加，當(dāng)加入0.3 g的纖維素酶時(shí)，達(dá)到最大值，再增加酶用量，青蒿素的提取率基本不變。

2.4 不同酶反應(yīng)溫度對(duì)青蒿素提取的影響

按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纖維素酶，分別在 40、45、50、55℃下水浴振蕩反應(yīng)，酶反應(yīng)緩沖液pH值為4.5，反應(yīng)時(shí)間為1 h，測(cè)定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進(jìn)行提取的樣品中青蒿素含量為100%進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖4。隨著溫度的增加，青蒿素的提取率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在酶反應(yīng)溫度為45℃時(shí)達(dá)到最大值。

圖4 不同酶反應(yīng)溫度對(duì)青蒿素提取率的影響

2.5 不同酶反應(yīng)pH值對(duì)青蒿素提取的影響

按照2.1中的方法，在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纖維素酶，在45℃下水浴振蕩反應(yīng)，酶反應(yīng)緩沖液pH值分別為4.0、4.5、5.0和 5.5，反應(yīng)時(shí)間為1 h，測(cè)定酶輔助提取后樣品青蒿素含量。以不加入纖維素酶進(jìn)行提取的樣品中青蒿素含量為100%進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果如圖5。酶反應(yīng)的pH值對(duì)青蒿素的提取率基本無(wú)影響，在pH值為4.5時(shí)，青蒿素提取率達(dá)到最大值。

2.6 纖維素酶輔助提取青蒿素工藝條件的優(yōu)化

在纖維素酶輔助提取青蒿素的過(guò)程中，酶反應(yīng)時(shí)間、酶的添加量和酶反應(yīng)溫度對(duì)青蒿素的提取影響較大，而酶反應(yīng)過(guò)程中緩沖液的pH值對(duì)青蒿素的提取基本無(wú)影響。因此，選取酶反應(yīng)時(shí)間、酶添加量和反應(yīng)溫度作為主要影響條件，利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design expert 7.5作三因素兩水平正交實(shí)驗(yàn)L4（23），正交實(shí)驗(yàn)水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平表

按照軟件設(shè)計(jì)的正交實(shí)驗(yàn)表中各因素水平，開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，然后對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。正交實(shí)驗(yàn)表和結(jié)果分析見(jiàn)表2。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析表明：酶輔助提取反應(yīng)各條件對(duì)提取率的影響試驗(yàn)中，酶反應(yīng)時(shí)間（A）的最優(yōu)值為水平1，酶添加量（B）的最優(yōu)值為水平2，溫度（C）的最優(yōu)值為水平2，實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)輔助提取反應(yīng)的影響順序?yàn)椋好阜磻?yīng)時(shí)間>酶添加量>溫度。

表2 三因素兩水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用Design expert7.5對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析結(jié)果表明：在P<0.05的情況下，試驗(yàn)中三個(gè)因素對(duì)提取率的影響均為不顯著。因此，選取實(shí)驗(yàn)中各因素水平的最優(yōu)值組合，即A1B2C2，作為酶輔助提取的最佳條件。此時(shí)，測(cè)定樣品中青蒿素的含量達(dá)到最大值3.34 mg。因此，纖維素酶輔助提取青蒿素的最佳工藝條件為：酶反應(yīng)時(shí)間為2 h，酶添加量為0.30 g，反應(yīng)溫度為45℃。在此條件下，通過(guò)酶輔助提取得到青蒿素的提取率為3.34 mg/g，與未使用酶輔助提取的方法青蒿素提取率1.13 mg/g相比，優(yōu)化后酶輔助提取方法中青蒿素提取率提高了1.96倍。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3 討論

黃花蒿為菊科艾屬一年生草本植物，在我國(guó)各地均有分布[6]。青蒿素是從黃花蒿干燥地上部分分離提取得到的一種新型化合物，其具有含過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，與已知抗瘧藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)完全不同[7]，被世界衛(wèi)生組織稱為“唯一有效的瘧疾治療藥物”。由于青蒿素的化學(xué)合成尚未顯示出商業(yè)可行性，目前商用的青蒿素主要通過(guò)植物提取[8]。工業(yè)化提取青蒿素中應(yīng)用范圍最廣的是有機(jī)溶劑提取法，但存在提取效率低、提取率不高、溶劑消耗大和安全隱患等問(wèn)題[3]。

天然產(chǎn)物的有效成分主要存在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞壁的阻礙影響了提取率。纖維素酶是最常見(jiàn)的破壁酶，它可作用于天然產(chǎn)物纖維素為主的細(xì)胞壁，破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞內(nèi)活性成分的溶出量，提高提取率[9]。纖維素酶Cellulase T4來(lái)源于綠色木霉，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，纖維素酶能夠有效降解青蒿植物的細(xì)胞壁，增加青蒿素的提取率。不同的纖維素酶有不同的最佳反應(yīng)條件，常見(jiàn)的影響因素有溫度、pH、酶的用量、激活劑和抑制劑等[10]。本文單因素及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Cellulase T4水解青蒿植物細(xì)胞壁的最佳條件為酶反應(yīng)時(shí)間為2 h，酶添加量為0.30 g，反應(yīng)溫度為45℃，酶反應(yīng)pH值4.5。在最優(yōu)條件下，纖維素酶輔助提取青蒿素較未使用酶輔助的提取方法，提取率提高了1.96倍。本實(shí)驗(yàn)為纖維素酶在青蒿素提取方面的應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)，為酶技術(shù)在中藥制藥方面的研究和應(yīng)用開(kāi)拓了更為廣闊的空間。

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Study of cellulose assisted extraction of Artemisinin fromArtemisia annua L.

LU Wan-yi

Department of Pharmaceutics,Guangdong Food and Drug Vocational-Technical School,Guangzhou 510663,China

ObjectiveTo study the factors affecting the yield of Artemisinin extracted fromArtemisia annuaL.by using cellulose assisted extraction.MethodsThe content of Artemisinin was determined by using UV spectrophotometric.The effects of reaction time,cellulose dose,reaction temperature,and pH value in the enzymatic reaction were studied,and then orthogonal experiments were carried out to find the optimum operating conditions.ResultsThe optimal conditions of cellulose assisted extraction were found as follows:the reaction time,cellulose dose,reaction temperature and the pH value were 2 h,0.30 g,45℃and 4.5 respectively.ConclusionThe yield of Artemisinin extracted fromArtemisia annuaL.could be improved effectively by using cellulose assisted extraction.

Artemisinin;Cellulose;Extraction

R965.1

A

1674-4721（2013）08（c）-0014-03

2013-02-26 本文編輯：魏玉坡）