分段調控優化阿維拉霉素生產菌罐上發酵參數

潛媛媛 陳 敏 王 宏

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310012；2.浙江凱勝生物藥業有限公司，浙江 蘭溪 321100）

阿維拉霉素又名卑霉素、阿美拉霉素、肥拉霉素［1］，既是一種抗生素又是一種新型的消化促進劑和代謝調節劑［2］，主要抑制革蘭氏陽性菌，對革蘭氏陰性菌效果較差［3］。阿維拉霉素作為飼料添加劑，具有結構獨特、安全性高、毒性小、低殘留等優點，廣泛應用在禽畜飼料中。目前阿維拉霉素僅由美國禮來公司生產，并且受專利保護。國內外對阿維拉霉素罐上發酵的研究較少，多數通過優化搖瓶發酵工藝以提高阿維拉霉素產量［4－6］，且鮮少有對阿維拉霉素的罐上發酵過程進行分段調控的研究。

阿維拉霉素是綠色產色鏈霉菌（Streptomyces viridoehrongenes）的次級代謝產物，一般在菌體生長的對數期后期或穩定期合成。本試驗擬以阿維拉霉素生產菌Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株為研究對象，通過分段調控并結合正交試驗對其罐上發酵過程中的溫度、pH等參數進行優化，旨在提高該菌株罐上發酵合成阿維拉霉素的產量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

綠色產色鏈霉菌 （Streptomyces viridoehrongenes）N－0104：浙江凱勝生物藥業有限公司；

藤黃微球菌 （Microccus luteus）10209：中國工業微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要儀器與設備

全溫振蕩培養箱：HZ－F160型，太倉市實驗設備廠；

發酵罐：BIOTECH－2002型，上海保興生物設備工程有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ－LS－75Ⅱ型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；

可見分光光度計：JH721型，上海菁華科技儀器有限公司；生化培養箱：SHP－250型，上海森信實驗儀器有限公司；多功能微生物自動測量分析儀：ZY－300IV型，北京先驅威鋒科技開發公司；

pH計：DELTA 320型，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司。

1.1.3 培養基及主要試劑

活化 培 養 基 （g／L）：可 溶 性 淀 粉 20.0，KNO31.0，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，瓊脂20.0，pH 7.2～7.4。

種子培養基（%，質量分數）：黃豆餅粉1.5，酵母粉0.25，葡萄糖0.5，糊精2.0，氯化鈣1.8，碳酸鈣0.1，pH 6.4～6.7。

發酵培養基（%，質量分數）：葡萄糖1.8，黃豆餅粉1.3，精制豆油1.0，氯化鈣1.8，碳酸鈣0.5，氯化鈉0.1，硝酸鈉0.45，氯化錳0.005，七水硫酸亞鐵0.005，硫酸鎂0.005，硫酸鋅0.005，硫酸銅0.001，硫酸鈷0.001，硫酸銨0.2，玉米淀粉4.0，消泡劑0.03，pH 6.6～6.9。

檢定培養基（g／L）：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.0～7.2。

阿維拉霉素預混劑：10%（質量分數），美國禮來公司。

1.2 培養方法

1.2.1 種子培養 用接種鏟取1cm×1cm的單菌落菌種塊，接入裝有100mL種子培養基的1 000mL錐形瓶中，28℃、200r／min條件下培養48h。

1.2.2 發酵培養

（1）搖瓶發酵培養：按10%（體積分數）的接種量取種子培養液，在無菌條件下接入裝有50mL發酵培養基的250mL錐形瓶中，28℃、200r／min條件下培養一定時間，并在培養了24h時補加0.1%（質量分數）的L－纈氨酸。

（2）罐上發酵培養：按10%（體積分數）的接種量在裝有7L發酵培養基的10L發酵罐中接入種子培養液，在28℃，通氣量1∶1，溶氧30%，罐壓0.03～0.05MPa下培養一定時間，并在培養了24h時補加0.1%（質量分數）L－纈氨酸。

1.3 測定方法

1.3.1 pH的測定 取10mL培養一定時間的發酵液，搖勻后在pH計上直接讀數。

1.3.2 菌體濃度的測定 根據文獻［7］測定。

1.3.3 還原糖和總糖的測定 采用 DNS法［8］。

1.3.4 氨態氮的測定 采用甲醛滴定法［9］。

1.3.5 阿維拉霉素含量的測定 采用微生物檢定法［10］。

1.4 罐上發酵條件優化試驗

1.4.1 變溫發酵條件優化 根據Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株搖瓶生長曲線確定菌種的搖瓶發酵生長期和阿維拉霉素合成期，設計菌株生長期溫度和阿維拉霉素合成期溫度的2因素3水平正交試驗，通過搖瓶變溫發酵確定最優組合。然后進行Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株罐上變溫發酵驗證，并對菌株罐上變溫發酵與恒溫發酵的阿維拉霉素產量進行比較。

1.4.2 罐上發酵pH調控 阿維拉霉素生產菌的菌體生長較適pH為7.0～7.2，所以培養基滅菌后pH調在7.1左右［7］。而由于堿性條件下有利于阿維拉霉素生產菌產素，所以在菌體后期阿維拉霉素合成期分別控制pH在7.5，8.0，8.5，進行比較選擇 Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株后期阿維拉霉素合成的最適pH。

2 結果與分析

2.1 變溫發酵條件優化

2.1.1 搖瓶發酵生長曲線 按1.2.2中搖瓶發酵培養方法進行Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株的搖瓶發酵。考察菌株搖瓶發酵過程各代謝參數的變化，結果見圖1、2。

圖1 搖瓶培養條件下培養基pH及還原糖變化曲線Figure 1 Time course of pH and reducing sugar of medium in 250mL－triangle flasks

圖2 搖瓶培養條件下菌體濃度及效價變化曲線Figure 2 Time course of cell volume and titer in 250mL－triangle flasks

由圖2菌體濃度－時間曲線可知，搖瓶發酵前期菌體生長速度快，菌體濃度快速增加。隨著發酵時間的增加，菌體濃度增加的速度變慢。當發酵進入后期時，由于培養基營養成分不足造成菌體自溶，菌體濃度下降。由效價－時間曲線可知，0～4d主要為菌體的生長期，阿維拉霉素合成很少。4d之后阿維拉霉素效價上升速度加快，阿維拉霉素不斷積累。9d之后阿維拉霉素產量變化很小，其中10d時達到最大 值 700.14mg／L。 可 以 確 定 Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株的搖瓶發酵周期為10d，其中0～4d為菌體生長期，5～10d為菌體阿維拉霉素合成期。

2.1.2 搖瓶變溫發酵試驗 由文獻［7］和［11］可知，阿維拉霉素生產菌的培養溫度一般為28℃，故以28℃為中心點，設計Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株搖瓶變溫發酵的2因素3水平正交試驗。正交試驗因素及水平見表1，正交試驗結果分析見表2及表3。

由表2可知，因素A對于菌體濃度來說是主要因素，對于效價來說是次要因素，但是對于兩個指標來說都是以A2為最佳水平，選取A2。因素B對于效價來說是主要因素，對于菌體濃度來說是次要因素，根據在確定某個因素的水平時首先應選擇該因素作為主要因素的優水平的原則［12］，選取B1。由表3可知，因素A與B對菌體濃度有影響，因素A與B對效價有高度顯著的影響。最終變溫發酵的條件為生長期溫度28℃，阿維拉霉素合成期溫度25℃，在該條件下搖瓶發酵阿維拉霉素的效價為820.83mg／L。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test／℃

表2 變溫發酵正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test of changing temperature fermentation

表3 變溫發酵正交試驗結果方差分析表?Table 3 Variance analysis of orthogonal test of changing temperature fermentation

2.1.3 罐上變溫發酵驗證 按1.2.2中的罐上發酵培養方法進行Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株的罐上變溫發酵，其中發酵溫度根據生長期28℃，阿維拉霉素合成期25℃進行分段調控。考察菌株罐上變溫發酵過程各代謝參數的變化，結果見圖3、4。

由圖3pH－時間曲線可知，發酵前期，Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌體生長，消耗培養基內的速效碳源，分解糖類等營養物質，產生酸、醇等小分子物質，使得發酵初期pH下降。隨著發酵的進行，培養基中糖逐漸缺乏，pH開始上升。在2～4d，由于培養基中的氮源被分解利用后產生NH3，所以在糖代謝和氮代謝的綜合作用下，pH迅速上升。之后菌絲體大量積累，代謝產物的合成速度加快，而由于碳酸鈣的存在，pH的變化很小。

圖3 罐上變溫發酵培養基pH及還原糖變化曲線Figure 3 Time course of pH and reducing sugar in a 10Lfermenter

由還原糖－時間曲線可知，發酵初期由于菌體生長過程中會合成酶分解淀粉，使得發酵液中還原糖含量出現略有升高的現象。隨著發酵時間的增加，發酵液中還原糖含量呈下降的趨勢。發酵前期，發酵液中還原糖含量下降速度快。第4天之后，發酵液中還原糖含量接近15mg／mL。隨著發酵過程進入后期，發酵液中還原糖含量下降的趨勢變得緩慢，發酵結束時發酵液中還原糖的含量為8.79mg／mL。

圖4 罐上變溫發酵菌體濃度及效價變化曲線Figure 4 Time course of cell volume and titer in a 10Lfermenter

由圖4菌體濃度－時間曲線可知，10L發酵罐罐上發酵過程中，菌體在發酵前期生長旺盛，菌體濃度增加速度快。發酵時間達到4d之后菌體濃度增加速度變慢，所以第4天之后發酵溫度調至25℃。而發酵10d之后由于發酵罐中培養基營養成分不足，菌體開始自溶，菌體濃度也略有下降。

由效價－時間曲線可知，0～4d主要為菌體的生長期，只有很少量的阿維拉霉素合成。4d之后開始進入阿維拉霉素合成期，此時發酵溫度為25℃，菌體合成阿維拉霉素速度快，阿維拉霉素不斷積累。8d之后發酵液中阿維拉霉素產量增加緩慢。第10、11天時阿維拉霉素產量為960mg／L左右，并且變化很小，說明此時阿維拉霉素產量已達到最大值。因此 確 定 Streptomyces viridoehrongenes N－0104 菌 株 的10L發酵罐罐上變溫發酵周期為10d，其中0～4d為菌體生長期，5～10d為菌體阿維拉霉素合成期。

2.1.4 罐上變溫發酵與恒溫發酵比較 將2.1.3中的Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株罐上變溫發酵阿維拉霉素產量與菌株罐上恒溫發酵結果進行比較，結果見圖5。

由圖5可知，當Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株進行罐上恒溫發酵時，在第11、12天時阿維拉霉素產量變化已經很小，達到最大值735.27mg／L，可以確定菌株罐上恒溫發酵的周期為11d。當菌株進行罐上變溫發酵時，第10、11天時阿維拉霉素產量沒有明顯差異，達到最大值963.28mg／L，比恒溫發酵的產量提高了31.01%，并且菌株罐上變溫發酵的周期為10d。說明罐上變溫發酵不僅能促進菌株合成阿維拉霉素，而且能縮短菌株的發酵周期。

圖5 恒溫發酵與變溫發酵結果比較Figure 5 Comparison of variable temperature fermentation result and constant temperature fermentation result

2.2 罐上發酵pH調控

pH值的大小不僅會影響發酵過程中酶的活性，還會影響培養基中營養成分和中間代謝產物的解離程度，從而影響到菌體的生長和代謝產物的合成等。在Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株罐上變溫發酵過程中，在控制培養基滅菌后pH為7.1左右的基礎上，對菌體阿維拉霉素合成期的pH進行聯動調控，并以不進行pH調控的發酵為對照組，結果見圖6。

圖6 pH對產阿維拉霉素的影響Figure 6 Influence of pH on avilamycin production

由圖6可知，當調控合成期pH為7.5時，Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株產阿維拉霉素的產量最高，為1 087.40mg／L，比對照組的產量（963.28mg／L）提高了12.89%。雖然堿性條件有利于阿維拉霉素的合成，但是當調控阿維拉霉素合成期pH在8.0和8.5時，由于一定程度上影響到發酵過程中一些前體物質的合成及酶的活性，所以阿維拉霉素的產量相對降低。

3 結論與討論

阿維拉霉素產生菌的發酵過程可以分為前期的生長期和后期的阿維拉霉素合成期，因此本試驗通過分段調控，并結合正交試驗對 Streptomyces viridoehrongenes N－0104菌株罐上發酵過程中的溫度、pH等參數進行優化。經微生物檢定法測定，采用優化后的罐上發酵條件所得的阿維拉霉素產量為1 087.40mg／L，較初始的產量（735.27mg／mL）提高了47.89%。說明阿維拉霉素產生菌罐上發酵分段調控能有效地提高阿維拉霉素的產量，這對阿維拉霉素的產業化具有很重要的意義。

1 陳永輝，劉波，曾兆國，等.阿維拉霉素的研究進展［J］.飼料工業，2007，28（14）：9～11.

2 Aarestrup F M，Seyfarth A M，Emborg H D，et al.Effect of abolishment of the use of antimicrobial agents for growth promotion on occurrence of antimicrobial resistance in fecal enterococci from food animals in Denmark［J］.Antimicrob Agents Chemother，2001，45（7）：2 054～2 059.

3 Weitnaucr G，Muhlenweg A，Trefzer A，et al.Biosynthesis of the orthosomycin antibiotic avilamycin A：deductions from the molecular analysis of the avi biosynthetic gene cluster of Strep tomyces viridochromogenes Tu57and production of new antibiotics［J］.Chembiol，2001，8（6）：569～581.

4 童應凱，靳亮，楊永濤，等.卑霉素搖瓶發酵工藝研究［J］.西北農林科技大學學報，2006，34（10）：32～36.

5 劉寧，王永星，張海龍，等.碳源對阿維拉霉素產量影響的研究［J］.山東教育學院學報，2008（4）：82～84.

6 靳亮，王澤立，童應凱，等.響應面法優化卑霉素發酵培養基的研究［J］.生物技術通報，2007（2）：155～162.

7 胡奇杰.阿維拉霉素生產菌推理選育及其發酵條件的初步研究［D］.杭州：浙江工商大學，2007.

8 田芳年，馬連榮.DNS法測定紅棗總糖含量［J］.化工技術與開發，2009（9）：125～126.

9 劉國文.尿素復合肥中氨態氮的測定［J］.廣西化工，1992，21（4）：32～34.

10 Formica G，Giannone C.Gas chromatographic determination of avilamycin total residues in pig tissues，fat，blood，feces and urine［J］.Assoe Off Anal Chem.，1986，69（5）：763～766.

11 張丹丹.阿維拉霉素產生菌的定向育種及機制研究［D］.杭州：浙江工商大學，2011.

12 潘麗軍，陳錦權，劉建學，等.試驗設計與數據處理［M］.第一版.南京：東南大學出版社，2008：117.